论文部分内容阅读
CD36作为长链脂肪酸受体,不但能促进长链不饱和脂肪酸的吸收、转运,而且与其它病原菌模式受体(如TLR4)结合参与到外源或者内源致病性物质的识别、清除并激活下游相关免疫信号通路,但CD36在乳腺中的免疫效能未见报道。本研究旨在对大肠杆菌(E.coli)引起的乳房炎中CD36发挥的作用及其与TLR4的关系对下游信号通路的影响,并进行长链不饱和脂肪酸(如亚麻酸)在LPS诱导的炎症过程中发挥的作用研究。本研究克隆了山羊CD36和TLR4序列,通过超表达或干扰CD36以及双分子荧光互补实验(BiFC)和免疫沉淀技术(IP)来探讨CD36与TLR4在E.coli及LPS中的相互关系以及对下游信号通路的影响。并通过构建CD36脂肪酸结合区域缺失突变体来研究长链不饱和脂肪酸脂肪酸能否通过CD36来发挥抑制炎症的功能。本论文获得以下主要研究结果:1.CD36和TLR4在E.coli引起西农萨能羊乳房炎中发挥的作用通过组织切片观测到乳腺腺泡在感染E.coli后的变化,以及炎性细胞的浸润。首次发现,与对照组相比在E.coli引起的奶山羊乳房炎中CD36与TLR4的mRNA表达水平显著升高(p<0.01),以及TLR4下游信号通路相关基因的mRNA(如MyD88)和蛋白水平(TRAF6,NF-kB p65,c-JNK,p38-MAPK)也均显著升高。E.coli引起的奶山羊乳房炎激活CD36和TLR4以及下游信号通路的表达。2.西农萨能羊CD36和TLR4基因的cDNA克隆及相关载体构建成功克隆了西农萨能奶山羊CD36和TLR4基因,并构建了CD36基因的腺病毒超表达载体,将包装成功的腺病毒Ad-CD36感染乳腺上皮细胞24h后,与空白对照组和感染空病毒组相比CD36的mRNA和蛋白水平有显著的增加(p<0.001)且空白对照组与空病毒组CD36无明显变化(p>0.05)。成功构建了CD36和TLR4的双分子荧光互补载体pBiFC-VN155-CD36和pBiFC-VC155-TLR4;同时构建了CD36和TLR4的超表达载体pef-NEO-Flag-CD36和pef-NEO-Myc-TLR4。这两类载体的构建为下一步CD36与TLR4相互作用研究提供了实验材料。3.CD36参与LPS刺激奶山羊乳腺细胞引起的炎症反应及下游信号通路的激活通过不同浓度LPS处理乳腺上皮细胞来寻找既能诱导炎症反应又不引起细胞凋亡或坏死的LPS浓度,用来建立LPS刺激奶山羊乳腺上皮细胞模型。并在该模型基础上超表达或者干扰CD36来探讨CD36对下游信号通路及细胞因子的影响。结果表明在LPS刺激奶山羊乳腺上皮细胞模型中,超表达或者干扰CD36后能激活TLR4/MyD88依赖的信号通路,同时激活下游转录因子NF-kB和AP-1的活性,其中AP-1活性的激活是通过c-JNK信号通路而不是p38-MAPK信号通路。并且下游炎性细胞因子除TGF-b外,IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α都会受到CD36超表达或者干扰的影响在LPS处理的细胞中。4.在乳腺上皮细胞中CD36与TLR4相互作用介导E.coli的内化通过BiFC技术初步验证了在奶山羊乳腺上皮细胞中用E.coli刺激后,CD36与TLR4发生相互作用,随后又通过免疫沉淀技术(IP)来再次验证了E.coli刺激乳腺上皮细胞后CD36与TLR4之间的相互作用。并且通过抗生素保护实验证明了在奶山羊乳腺上皮细胞中CD36介导E.coli的吞噬作用。5.多不饱和脂肪酸亚麻酸通过CD36抑制LPS诱导的炎症反应成功构建CD36127-279的过表达载体(Ad-CD36127-279和pef-NEO-Flag-CD36127-279)。发现了γ-亚麻酸(GLA)而不是亚油酸(LA)可以通过CD36来调节NF-kB的活性。当干扰CD36或者缺失CD36脂肪酸结合区域时,GLA在抑制LPS诱导的炎症中功能将会削弱,包括影响NF-kB的活性级下游炎性因子表达。综上所述,本研究初步阐明了CD36参与E.coli引起的奶山羊乳房炎引起的炎症反应,能够激活下游相关信号通路,在识别、内化E.coli的过程中发现了CD36与TLR4相互作用。此外,长链不饱和脂肪酸是通过CD36来发挥抑制炎症的功能。本实验为奶山羊乳腺免疫功能的调控机理研究提供了理论和实验依据。