一、研究背景慢性炎症的发生发展是通过不断的释放失去调节的细胞因子、大量募集炎性细胞以及增加血管通透性造成组织器官的损伤。在这一过程中，血管内皮细胞的粘附和结构屏障功能变化起到了关键作用。研究证实，炎性细胞因子如白介素1β（IL-1β)在体内可以引起循环中的白细胞迁出并在损伤组织间隙聚集。目前已知该反应中，白介素1β可通过与胞膜上受体结合激活髓细胞样分化蛋白88（MyD88)介导的核转录因子κB（NF-κB）依赖的信号通路，促进白细胞的粘附、变形和迁出。然而对于白介素1β导致血管屏障功能的损伤，增加血管的通透性，其具体是否也依赖于NF-κB通路的激活，目前仍不得而知。血管内皮在循环系统和周围组织间产生结构型屏障,调控血管中血浆成分和血细胞的向周围组织渗漏。血管的通透性由两种途径调节：一种是经细胞通透途径;另一种是细胞旁通透途径。在炎症反应时,细胞旁通透途径对于血管内皮通透性的调节尤为重要。细胞旁通透途径主要由内皮细胞间连接调控，通过对内皮细胞超微结构的观察发现，粘附连接是血管内皮细胞间的主要连接形式。而构成内皮间粘附连接的主要分子是血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）。它是血管内皮细胞特异性钙黏蛋白，其结构和分布对于维持血管内皮细胞的生理功能起着重要的作用。ADP核基环化因子6(Arf6)是ras超家族中的一个小分子GTP结合蛋白，属于ARF亚家族成员，分子量仅20kD左右，在真核生物细胞中广泛表达并且序列及其保守。目前研究发现ARF6主要参与调节细胞质膜运输和胞内肌动蛋白装配而涉及到多种生理功能,包括囊泡内吞、分泌、膜出芽、胞质分裂、吞噬、细胞粘连、细胞迁移等。Arf6的活化受到GTP酶激活蛋白(GAPs)和鸟苷交换因子(GEFs)的共同调节。Arf-GAPs是负调节因子，能催化与Arf6结合的GTP水解成GDP而抑制它的活性，而Arf－GEFs是正调节因子，能促进ARF6-GDP向ARF6-GTP的转换从而激活Arf6。在我们之前的研究中发现Arf6的活化程度与血管内皮的屏障功能有密切联系：阻断Arf6激活可以稳定血管内皮，激活Arf6可以增加新生血管的发生以及血管内皮通透性。探寻炎症发生时血管内皮通透性改变的机制，研究炎性细胞因子IL-1β对于血管内皮细胞影响的具体通路，都可以为存在炎症反应的疾病治疗提供解决的靶点提示。二、研究目的本课题拟研究白介素-1β通过何种信号转导途径影响血管内皮通透性；Arf6与VE-cadherin之间的关系，如何通过调控Arf6来影响VE-cadherin的表达分布，协调内皮细胞间连接稳定性；寻找IL-1β、Arf6以及VE-cadherin相互之间是否有联系；并选取慢性炎症的动物模型（CIA）验证体外实验的结论。三、材料和方法购买HMVECs原代并进行培养扩增，第5代细胞用于实验。GTP-Arf6pull down实验检测全细胞裂解液中Arf6GTP形式的含量。单细胞层的电阻用ECIS系统(AppliedBiophysics)检测，数据单位为欧姆。利用Transwell系统检测单细胞层对辣根过氧化物酶的渗透量。细胞免疫荧光染色、细胞膜组分分离以及Western免疫印记等方法检测HMVECs细胞膜上VE-cadherin的量及分布形态。购买带有Arf6-Q67L基因片段或绿色荧光蛋白的腺病毒载体，按照适当浓度感染HMVECs，感染48小时后进行实验。购买目的基因的siRNA溶解分装后，以Hiperfect转染试剂进行两次基因干扰，第二次干扰后48小时用实验。利用PCR、酶切、连接、转化、筛选、测序以及扩缯培养、质粒抽提等方法构建并获得大量MyD88和ARNO的全长及功能片段载体，以脂质体将目的片段转染至293T细胞中，转染48小时后进行免疫共沉淀实验。牛Ⅱ型胶原蛋白溶液与完全弗氏佐剂注射DBA/1J小鼠,21天后与不完全弗氏佐剂再次注射得到胶原诱导性关节炎动物模型。利用关节炎指数进行评分分组，经过DMSO、SecinH3以及Enbrel处理后，进行组织学检查。三、结果1. IL-1β诱导血管通透性的增高不依赖于NF-κB通路加入核因子-κB抑制因子激酶（IKK）的抑制剂（SC514）可以阻断IL-1β诱导的NF-κB由胞浆移入细胞核，但是它不能阻止IL-1β诱导的HMVECs单细胞层跨膜电阻降低，对辣根过氧化物酶的通透性增高以及细胞膜表面VE-cadherin减少。在内皮细胞培养过程中加入已知IL-1β激活的下游信号通路分子ERK1/2, p38和JNK的抑制剂可以分别阻断各自的信号通路激活，但是它们都不能阻止IL-1β诱导的HMVECs的单细胞层对辣根过氧化物酶通透增加，跨膜电阻减低以及细胞表面VE-cadherin定位分布的减少。2. IL-1β破坏血管内皮屏障功能，增加血管通透性，与IL-1β--MyD88--ARNO--Arf6--VE-cadherin的信号通路激活有关通过Arf6pull down实验发现，在HMVECs中IL-1β可以迅速并持久的使Arf6GTP形式增加；在经过Arf6RNA干涉处理的HMVECs中，Arf6表达降低，进而检测到在加入IL-1β刺激的HMVECs单细胞层较未处理者对辣根过氧化物酶通透性降低，细胞膜表面定位分布的VE-cadherin增加并且与未加IL-1β刺激者相比无显著变化。在感染持续激活的Arf6基因片段的HMVECs中发现，激活的Arf6增加促进了单细胞层跨膜电阻的降低以及VE-cadherin在细胞膜的定位分布的减少。在HMVECs中加入ArfGAP抑制剂QS11，Arf6GTP形式显著增加，QS11处理的HMVECs单细胞层较DMSO处理者的跨膜电阻的降低，对辣根过氧化物酶通透性增加，细胞膜表面定位分布的VE-cadherin减少并出现排列紊乱。cytohesins(GEF家族成员)的小分子抑制剂SecinH3处理HMVECs后发现，细胞膜表面VE-cadherin在细胞膜表面的分布增加，并可以抑制IL-1β刺激引起的Arf6GTP形式增加，同时挽回IL-1β引起的单细胞层跨膜电阻的降低，阻止对辣根过氧化物酶通透性增加，稳定细胞膜表面定位分布的VE-cadherin。经过ARNO(GEF家族成员) RNA干涉的HMVECs，加入IL-1β不仅不能再引起Arf6GTP增加，而且阻止了处理组单细胞层在IL-1β刺激下对辣根过氧化物酶通透性改变以及细胞膜表面VE-cadherin分布。利用siRNA干扰技术分别将白介素1受体已知下游通路的分子依次knock down，发现siRNA干扰MyD88的表达可以抑制IL-1β诱导的Arf6GTP增加并阻断其诱导的对辣根过氧化物酶通透性增加，但是siRNA干扰IRAK表达不能做到这些。利用免疫共沉淀的方法，研究MyD88、ARNO全长之间；MyD88各功能片段与ARNO全长之间；ARNO各功能片段与MyD88全长之间的关系。结果发现，MyD88和ARNO之间有直接的相互连接。3.抑制Arf-GEFs可以降低CIA诱导的血管通透性和关节炎的严重性，MyD88-ARNO-Arf6通路可以作为类风湿性关节炎治疗的有效靶点在标准的慢性炎性关节炎动物模型即胶原诱导性关节炎（CIA）中给予阻断IL-1β-MyD88-ARNO-Arf6通路的Arf-GEFs的抑制剂SecinH3进行治疗。结果发现，SecinH3可以明显抑制被CIA诱导的血管通透性增加，关节炎的发展明显减轻，表现为炎症反应、血管翳生成、软骨损伤和骨损伤都明显减少。四、结论1. IL-1β诱导血管通透性的增高是不依赖于NF-κB通路的。2. IL-1β破坏血管内皮屏障，增加血管通透性与IL-1β-MyD88-ARNO-Arf6-VE-cadherin的信号通路激活紧密相关。GAPs和GEFs可以通过调控Arf6的活化，影响血管内皮通透性，其中ARNO是HMVECs中激活Arf6的GEF家族中关键的分子。3. IL-1β与血管内皮屏障通透性之间，IL-1β-MyD88-ARNO-Arf6-VE-cadherin信号通路确实存在，并且MyD88-ARNO-Arf6通路可以作为类风湿性关节炎治疗的有效靶点。