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研究目的:糖尿病是导致骨质疏松症的主要原因之一,由于胰岛素抵抗或缺乏导致脂质、葡萄糖、钙代谢紊乱等,成骨细胞和破骨细胞功能失调,最终导致骨转换率降低、骨脆性增加、全身性骨质流失,以及骨折发生率升高。运动防治骨质疏松的作用已被广泛认可,运动能改善骨生物力学,有效减少骨量流失。Chemerin是一种新型脂肪因子,与糖尿病、肥胖等疾病的发生发展密切相关。研究发现,肥胖、糖尿病及骨质疏松症患者的血清chemerin水平升高;且老年男性及肥胖女性的腰椎和股骨骨密度与血清chemerin水平呈负相关。Chemerin信号通路已被证实能够调控骨重塑过程,无论是在体水平还是细胞水平均发现chemerin能够促进破骨、抑制成骨,但仍有一部分研究报道chemerin能促进骨形成,这可能与chemerin的不同受体和不同表达部位有关。因此,chemerin对骨代谢的调控作用及机制仍未完全阐明。我们课题组前期的研究已报道,有氧运动所致的chemerin减少在运动改善糖尿病小鼠糖脂代谢紊乱中发挥重要作用。基于chemerin对骨代谢的调控作用,我们推测chemerin的减少可能也是运动改善骨代谢的作用机制之一。因此,本文的研究目的,一是用外源补充chemerin明确chemerin减少是否是有氧运动改善糖尿病小鼠骨密度及骨微结构的机制之一;二是用脂肪特异性chemerin敲除小鼠研究脂肪chemerin敲除在有氧运动改善普通和高脂膳食喂养小鼠的骨密度、骨微结构和调控骨代谢关键分子中的作用,以验证chemerin在运动调控骨代谢中的作用、并探讨作用机制。研究方法:1.外源补充chemerin对运动糖尿病小鼠骨密度、骨微结构的影响1)糖尿病模型小鼠的造模和分组44只6周龄雄性ICR小鼠采用6周高脂饲料喂养+一次空腹腹腔注射STZ的方法复制2型糖尿病模型小鼠。造模成功的标准是STZ注射后的第3天和第7天的空腹血糖水平均大于11.1 mmol/L。将造模成功的糖尿病模型小鼠随机分为糖尿病组（diabetes mellitus,DM）、糖尿病运动组（exercised DM,EDM）和糖尿病运动+外源补充chemerin组（EDM+chemerin,EDMC）,每组 6 只。2)有氧运动方案和外源补充chemerin方法EDM组和EDMC组小鼠进行为期6周的递增负荷中等强度跑台运动（从10 m/min增至14 m/min）,每周运动6d,1 h/d。EDMC组小鼠在第4周开始外源补充chemerin（按8 ng/g体重的剂量,在运动干预前30 min腹腔注射）,每周注射6 d,每天1次。3)小鼠骨密度、骨微结构的检测运动结束后麻醉处死小鼠、取材。迅速取出股骨和胫骨,用纱布剥离骨组织表面的肌肉韧带等结缔组织,在液氮中速冻后放-80℃冰箱保存备用。Micro-CT检测左侧股骨骨密度和骨微结构。检测指标有:①皮质骨:厚度（cortical bone thickness,Ct.Th）和骨体积百分比（bone volume/tissue volume,BV/TV）;②骨小梁:BV/TV、骨小梁的数量（trabecular number,Tb.N）、连接密度（connectivity density,Conn.D）、结构模型指数（structure model index,SMI）和分离度（trabecular separation,Tb.Sp）。2.脂肪特异性chemerin敲除对小鼠骨密度、骨微结构、成骨破骨相关因子的影响及运动的调控作用1)脂肪特异性chemerin敲除小鼠的构建及鉴定采用Cre-loxP系统构建脂肪特异性chemerin敲除小鼠（上海南方模式生物技术公司）。新生小鼠养至两周龄时,取0.5cm鼠尾进行DNA检测以筛选出脂肪特异性chemerin敲除小鼠;在8周龄时检测脂肪、肝、肺、肾等的chemerin蛋白水平,以确证是脂肪特异性chemerin敲除小鼠。2)小鼠分组将8周龄雄性的野生型小鼠和chemerin敲除纯合子小鼠,随机分为高脂膳食组和普通膳食组,分别喂以高脂和普通饲料。然后,将普通膳食组小鼠分为4 组:普通对照组（Control）、普通运动组（Control+Exercise,Control+E）、chemerin 敲除组[chemerin（-/-）]和 chemerin 敲除+运动组[chemerin（-/-）+E]。高脂膳食组小鼠的分组与普通膳食组的类似,也是4组,分别是高脂对照组（high fat diet,HFD）、高脂运动组（HFD+E）、高脂chemerin敲除组[HFD+chemerin（-/-）]和高脂 chemerin 敲除+运动组[HFD+chemerin（-/-）+E]。3)小鼠有氧运动方案、骨密度、骨微结构的检测小鼠的6周有氧运动方案,股骨和胫骨的取材方法,以及骨密度、骨微结构的检测方法,同上。4)成骨破骨相关因子的mRNA和蛋白水平的检测Real time PCR检测左侧胫骨成骨破骨相关因子的mRNA水平,Western blot检测右侧胫骨成骨破骨相关蛋白表达。研究结果:1.外源补充chemerin减弱运动对糖尿病小鼠松质骨的骨密度和骨微结构的改善作用1)相较于正常小鼠,糖尿病小鼠松质骨的骨密度降低、骨微结构受损;但皮质骨无显著变化。2)6周有氧运动显著提高糖尿病小鼠松质骨的骨密度,增加骨小梁数量,改善骨微结构;但对没有改变的皮质骨无显著影响。3)外源补充chemerin能逆转有氧运动对糖尿病小鼠松质骨的改善作用。2.普通膳食下,脂肪chemerin敲除对安静和运动小鼠松质骨的结构、成骨破骨相关因子mRNA及蛋白水平的影响1)脂肪chemerin敲除及6周有氧运动对普通膳食小鼠的骨密度及骨微结构无显著影响。2)普通膳食下,脂肪chemerin敲除对安静小鼠能增加某些促进骨形成、抑制骨吸收的因子（如Runx2和OPG）mRNA水平,而对运动小鼠能增加成骨标志蛋白ALP的蛋白水平、降低破骨标志蛋白CTSK的蛋白水平。3.高脂膳食下,脂肪chemerin敲除对安静和运动小鼠松质骨的结构、成骨破骨相关因子mRNA及蛋白水平的影响1)高脂膳食下,脂肪chemerin敲除改善安静和运动小鼠松质骨的骨结构,且chemerin敲除能进一步提高运动的改善作用。2)高脂膳食下,脂肪chemerin敲除对运动小鼠能上调成骨相关基因Runx2、Osterix的mRNA水平,下调破骨相关基因RANKL、M-CSF的mRNA水平;而对安静和运动小鼠能增加成骨标志蛋白ALP、降低破骨标志蛋白CTSK的蛋白水平;且chemerin敲除进一步增强运动对ALP、CTSK的调控作用。研究结论:1.Chemerin减少在有氧运动改善雄性糖尿病小鼠松质骨的骨结构中发挥重要作用。2.脂肪chemerin敲除不仅改善高脂喂养小鼠松质骨的骨结构,而且可进一步提高运动对松质骨骨结构的改善作用;且该作用与chemerin敲除增加促进骨形成的蛋白及mRNA水平（如ALP、Runx2、Osterix）、降低抑制骨吸收的蛋白及mRNA水平（如CTSK、RANKL、M-CSF）有关。