β-葡萄糖苷酶是一类可以水解结合于末端、非还原性的β-D-葡萄糖苷键并释放相应配基和葡萄糖的酶,在食品增香、纤维素降解、糖基化合物合成、氰苷的脱除等方面都具有广泛的应用前景。橡胶籽作为一种具有潜在经济价值的热带作物资源,富含不饱和脂肪酸、蛋白、维生素等营养物质,但因生氰糖苷类物质的存在该资源未能合理利用。为了充分利用橡胶籽资源,本文以橡胶籽内源β-葡萄糖苷酶作为研究对象,探究其热稳定性以及底物特异性,以期推广橡胶籽β-葡萄糖苷酶在各领域的研究利用。以荧光猝灭法结合分子对接,探究橡胶籽β-葡萄糖苷酶与槲皮素作用机制,对所建蛋白模型以及分子对接实验结果的可靠性进行验证;测定橡胶籽β-葡萄糖苷酶水解不同类别底物的米氏常数,结合分子对接,探究橡胶籽β-葡萄糖苷酶的底物特异性;以对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(4’-Nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,pNPG)为底物,测定添加不同浓度的尿素、糖类后橡胶籽β-葡萄糖苷酶的热失活动力学参数,了解酶的热稳定性变化,探讨尿素及糖类的存在对β-葡萄糖苷酶热稳定性的影响。主要研究结果如下:同源建模得到的β-葡萄糖苷酶结构模板与槲皮素与对接,Ligplot中显示槲皮素与β-葡萄糖苷酶Gln45、His336、Glu467以及Asn468之间存在氢键。同时,槲皮素结合于酶蛋白的疏水腔内,β-葡萄糖苷酶的疏水基团与槲皮素之间存在疏水作用力。AutoDock Tools分析各作用力对结合能的贡献情况,推测槲皮素与酶蛋白作用过程,范德华力、氢键作用以及疏水作用为最主要的作用力。槲皮素与β-葡萄糖苷酶形成复合物,引起静态猝灭,AS0>0荧光猝灭过程中存在疏水相互作用,AG0<0、H0<0说明了氢键和范德华力的存在。AutoDock Tools分子对接与荧光猝灭实验结果的对比,虽然结合能测定值存在差异,但槲皮素与酶蛋白之间存在的作用力结果一致,用软件模拟的方法分析酶与底物的作用形式可靠性较高。采用高效液相法测定橡胶籽β-葡萄糖苷酶水解不同类型的底物的动力学参数,对比Km值,发现酶与氰苷、异黄酮亲和力较大,黄酮、酚苷次之,β-葡萄糖苷酶对于纤维寡糖的水解能力相对较弱。ADT中得出分子对接的结合能和抑制常数,按结合能排序依次为亚麻苦苷、大豆苷、pNPG、苦杏仁苷、黄豆黄苷、染料木苷、水杨苷、纤维二糖、蔗糖、麦芽糖,除水杨苷外其他底物均与Km测定的结果相符。添加低浓度的尿素时,β-葡萄糖苷酶水解pNPG的活力上升,极限温度下失活半衰期也得以延长,72℃下等电点纯化β-葡萄糖苷酶的热失活半衰期延长47.62%。β-葡萄糖苷酶溶液中添加高浓度尿素时,酶活下降明显,72℃下失活半衰期缩短30%。低浓度尿素作用下β-葡萄糖苷酶活性和稳定性提升,可能蛋白结构的变化有利于酶与底物的相互作用,酶活提升;同时该结构较为稳定,热处理时稳定性提升。通过对比添加三种单糖、低聚糖后β-葡萄糖苷酶热失活半衰期,发现糖添加后,酶在极限温度下(68、70、72℃)热失活半衰期均发生不同程度的延长。分子对接以及高效液相法测定β-葡萄糖苷酶水解各类型底物的结果显示,酶与三种低聚糖的亲和力远小于pNPG,两者共存时,低聚糖与反应体系中的水分子以氢键形式结合,减少水分子与酶蛋白之间氢键的形成。对比葡萄糖、麦芽糖与β-葡萄糖苷酶对接结果,葡萄糖与酶的结合能较低,同时以氢键形式与蛋白结合的能力较强,影响pNPG与β-葡萄糖苷酶的相互作用,从而葡萄糖对β-葡萄糖苷酶活性的保护效果弱于麦芽糖。