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目的1.观察氪激光建立实验性脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)模型的可行性和成功率,为CNV的相关实验研究奠定基础。2.观察 AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路与 TLR-4/NF-κB/IL-6 信号通路在CNV形成中的作用。3.观察中药加减驻景方和Conbercept对实验性CNV的干预作用,以及对AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路和TLR-4/NF-κB/IL-6信号通路活性的影响,比较不同治疗对CNV的干预效果,推测可能存在的干预机制,为CNV的治疗提供理论及实验性依据。方法1.通过659 nm氪激光诱导棕色挪威(brown Norway,BN)大鼠建立实验性CNV动物模型。分别于光凝后7 d、14 d、21 d,通过眼底荧光血管造影(fundus fluorescein angiograph,FFA)与引哚青绿血管造影(indocyanine green angiography,ICGA)检查观察CNV变化。FFA与ICGA检查后处死大鼠,制作眼组织病理学标本,通过HE染色和CD105免疫组织化学染色法观察CNV变化。2.通过659 nm氪激光诱导BN大鼠建立CNV动物模型。分别于光凝后7 d、14 d、21 d处死取材制作病理学标本,采用免疫组织化学法观察CNV组织中AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路与TLR-4/NF-κB/IL-6信号通路相关蛋白的表达量。于光凝后21 d,处死取材,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)技术检测 眼组织中AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路与TLR-4/NF-κB/IL-6信号通路相关因子mRNA的表达情况。3.通过659 nm氪激光诱导BN大鼠建立CNV动物模型。造模后的大鼠被随机分为模型组、中药组、西药组和联合治疗组。模型组大鼠用生理盐水灌胃,中药组用加减驻景方灌胃治疗,西药组用玻璃体腔注射Conbercept治疗,联合治疗组用玻璃体腔注射Conbercept和加减驻景方灌胃治疗。分别于光凝后7 d、14d、21d,进行FFA与ICGA检查。FFA与ICGA检查后每组处死6只大鼠制作病理学标本,通过HE染色观察CNV变化,通过免疫组织化学法观察各组大鼠 CNV 组织中 AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF 信号通路与 TLR-4/NF-κB/IL-6 信号通路相关蛋白的表达量。于光凝后21 d,每组处死12只大鼠获取眼组织标本,使用RT-qPCR和蛋白免疫印迹(Western blotting)检测观察各组大鼠AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF 信号通路与 TLR-4/NF-κB/IL-6 信号通路 mRNA 和蛋白的相对表达量。结果1.模型组BN大鼠光凝后7 d的FFA图像出现明显荧光素渗漏,14 d时渗漏强度逐渐增强(P<0.05),21 d时无明显变化(P>0.05),有荧光素渗漏的光斑在ICGA均呈充盈状态。光凝后7 d、14 d、21 d CNV发生率分别为77.08%、85.42%、89.58%,差异无统计学意义(P>0.05)。组织病理学结果显示随光凝时间推移,CNV中央厚度逐渐增加(P<0.05)。光凝后7 d,CNV中可见CD105因子标记的新生血管,阳性反应物呈棕黄色;14 d阳性反应物逐渐增多(P<0.05);21d无明显变化(P>0.05)。正常BN大鼠视网膜组织结构中CD105表达呈阴性,未见棕黄色反应物。2.AKT、mTOR、HIF-1α、VEGF、TLR-4、NF-κB 和 IL-6 蛋白在模型组BN大鼠视网膜组织中均呈强阳性表达,CNV组织中可见大量黄棕色阳性反应物。HIF-1α、TLR-4和IL-6蛋白在光凝后7 d时有明显表达,在14 d时达到高峰,21 d时逐渐减少(P<0.05)。AKT、mTOR蛋白表达量在7d时最多,21 d时缓慢减少(P<0.05)。VEGF在光凝后7d时表达量达到最大值,随后逐渐减少(P<0.05)。NF-κB在光凝后7 d时有明显表达,在14 d时达到高峰,21 d时变化不明显(P<0.05)。RT-qPCR结果显示,模型组AKT、mTOR、HIF-1α、VEGF、TLR-4、NF-κB与IL-6 mRNA相对表达量较对照组均有显著增强(P<0.05)。3.光凝后7 d、14 d、21 d,模型组与各治疗组CNV形成率达70%以上,差异无统计学意义(P>0.05)。各治疗组FFA荧光素渗漏在光凝后7 d时最强,随后变化不明显,有荧光渗漏的光凝斑在ICGA呈充盈状态。光凝后7 d,中药组与模型组荧光素渗漏强度较高,西药组次之,联合组渗漏程度最轻(P<0.05)。14 d与21 d时,各治疗组荧光素渗漏强度均弱于模型组,联合组治疗效果最优,西药组治疗效果优于中药组(P<0.05)。光凝后7 d,西药组和联合组CNV中央厚度都显著低于模型组和中药组(P<0.05)。光凝后14 d与21 d时,各治疗组CNV中央厚度均低于模型组,联合组降低CNV中央厚度的效果最优,西药组次之,西药组优于中药组(P<0.05)。免疫组织化学结果显示,各治疗组视网膜光凝区 CNV组织中AKT、mTOR、HIF-1α、VEGF、TLR-4、NF-κB 与 IL-6 蛋白的表达都呈阳性,CNV 组织中可见大量黄棕色阳性反应物。随着治疗时间延长,各治疗组目的蛋白表达量均低于模型组(P<0.05)。光凝后7 d到21 d,AKT、mTOR、HIF-1α和VEGF的表达量在中药组、西药组和联合组中呈现依次递减趋势(P<0.05),TLR-4和NF-κB表达量在西药组最高,联合组最低(P<0.05)。在光凝后7 d与14d时,联合组IL-6表达量低于西药组(P<0.05)。光凝后21 d,中药组和联合组均低于西药组(P<0.05)。RT-qPCR结果显示,模型组与各治疗组目的基因mRNA相对表达量较对照组均有明显增多(P<0.05)。除mTOR以外,各治疗组目的基因mRNA相对表达量均低于模型组(P<0.05),中药组mTOR mRNA相对表达量与模型组无明显差异(P>0.05)。各治疗组AKT、mTOR、VEGF和NF-κB mRNA相对表达量由高到低依次为中药组、西药组和联合组,差异有统计学意义(P<0.05)。中药组HIF-1αmRNA相对表达量高于西药组和联合组(P<0.05),西药组和联合组之间无明显差异(P>0.05)。TLR-4 mRNA相对表达量联合组最低(P<0.05),西药组与中药组无明显差异(P>0.05)。IL-6 mRNA相对表达量中药组最低(P<0.05),西药组与联合组无明显差异(P>0.05)。Western blotting结果显示,实验组各目的蛋白相对表达量较对照组均有明显增多(P<0.05),除AKT蛋白以外,各治疗组目的蛋白相对表达量均低于模型组(P<0.05)。AKT和HIF-1α蛋白相对表达量在中药组中高于西药组和联合组(P<0.05)。mTOR与VEGF蛋白相对表达量由高到低依次为中药组、西药组和联合组(P<0.05)。TLR-4蛋白相对表达量在西药组中高于中药组和联合组(P<0.05)。NF-κB蛋白相对表达量在中药组中高于西药组和联合组(P<0.05)。IL-6蛋白相对表达量在中药组中低于西药组与联合组(P<0.05)。结论1.659 nm氪激光诱导BN大鼠建立CNV模型成功率高,且具有与人类CNV相似的病理过程和细胞组成。2.FFA联合ICGA检查可以动态观察CNV变化,荧光渗漏强度AOD值可用于半定量评估CNV形成情况。3.AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF 信号通路与 TLR-4/NF-κB/IL-6 信号通路在 CNV动物模型中被激活。AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路与TLR-4/NF-κB/IL-6信号通路的活化促进了实验性CNV的形成。4.联合组干预CNV的效果明显优于中药组和西药组,中西药联合治疗对AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路与TLR-4/NF-κB/IL-6信号通路的活性具有明显的抑制作用。5.加减驻景方具有抑制实验性CNV的作用。加减驻景方可以降低AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路与TLR-4/NF-κB/IL-6信号通路的活性,加减驻景方可能是通过上述信号通路发挥多靶点抑制CNV的作用。