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第一部分：糖尿病大鼠视网膜氧化应激、ERK1／2信号通路激活以及VEGF分泌的研究目的：研究1)糖尿病大鼠模型早期视网膜是否出现氧化应激；2)糖尿病大鼠模型早期视网膜氧化应激是否激活了ERK1／2信号转导通路；3)糖尿病视网膜ERK1／2信号转导通路的激活与视网膜VEGF分泌的相关性；5)ERK1／2激活在视网膜Muller细胞上的表达。方法：腹腔注射STZ诱导糖尿病大鼠模型,取不同时间点：7天(d)、14天(d)、21天(d)、1月(m)、2月(m)和3月(m)进行各项实验。化学比色法检测氧化应激损伤相关指标,包括超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)浓度、丙二醛(MDA)浓度,电镜观察不同类型细胞(神经节细胞、Muller细胞、血管内皮细胞、周细胞、色素上皮细胞)线粒体的超微结构。Western-blot研究ERK1／2信号通路磷酸化激活的变化趋势。免疫组织化学的方法观察磷酸化激活的ERK1／2在视网膜中表达的部位。通过EMSA方法研究ERK1／2下游底物AP-1核转录因子激活的变化趋势。Real-time PCR以及Western-blot研究VEGFmRNA和蛋白表达量的变化趋势。为了观察氧化应激对ERK1／2信号通路的激活作用,给予药物Tocopherol干预氧化应激,Western-blot方法观察对视网膜ERK1／2磷酸化蛋白表达影响。结果：氧化应激相关检查显示在糖尿病7d时视网膜就出现氧化应激损伤,表现为SOD活性下降、GSH浓度下降、MDA浓度升高。糖尿病2m时表现出更显著的损伤指标(P<0.05)。电镜观察细胞线粒体,DM7d, Muller细胞及神经节细胞线粒体出现结构异常。Western-blot结果,DM7d时ERK1／2信号通路激活,至2m时达到高峰,期间有上下波动波动。EMSA结果显示糖尿病成模后AP-1DNA结合活性升高,并且波动趋势相似于磷酸化的ERKl／2。VEGF结果显示蛋白及mRNA表达量均升高,波动趋势相似于磷酸化ERK1／2及AP-1。通过干预氧化应激,ERK1／2磷酸化蛋白表达量下降。免疫组化结果显示DM7d视网膜内核层出现磷酸化ERK1／2的阳性颗粒,并且在DM2m时表达更为增加。讨论：1)在糖尿病模型极早期视网膜出现了氧化应激损伤,并且神经细胞的损伤早于血管细胞。2)在糖尿病模型极早期视网膜ERK1／2信号通路激活,VEGF蛋白量及mRNA表达升高,两者间波动趋势相似。ERK1／2下游核转录因子AP-1的波动也表现出类似趋势。3)干预氧化应激能抑制ERK1／2磷酸化激活,提示糖尿病环境下氧化应激可以激活ERK1／2信号通路。4)视网膜Muller细胞可能存在ERK1／2信号通路的激活。第二部分高糖刺激Muller细胞对氧化应激、ERKl／2信号通路及VEGF的分泌影响研究目的：研究1)体外培养的Muller细胞在高糖环境下氧化应激损伤；2)高糖环境下Muller细胞是否出现ERK1／2信号通路的激活；3)高糖环境下Muller细胞核转录因子AP-1是否激活；4)高糖环境下Muller细胞VEGF分泌的变化。方法：取新生大鼠视网膜Muller细胞纯化培养。传代后2-3代细胞,高糖(30mM)刺激不同时间：8h、12h、24h、36h、48h,流式细胞仪观察ROS生成,激光共聚焦显微镜观察线粒体膜电位的下降,电镜观察线粒体超微结构。Western-blot方法观察高糖刺激24h后ERK1／2磷酸化激活的表达量,细胞免疫荧光观察ERK1／2磷酸化激活的表达。EMSA方法观察高糖刺激24h后AP-1 DNA探针结合活性。Real-time PCR检测AP-1的主要组成元件c-Fos和c-Jun mRNA表达量。Real-time PCR检测高糖刺激8h、12h、24h、36h、48hVEGF mRNA表达量,ELISA检测高糖刺激8h、12h、24h、36h、48h培液中VEGF浓度。结果：随高糖刺激时间的不断延长细胞内ROS逐渐升高,在24h骤升(P<0.05)。高糖刺激24h后细胞线粒体膜电位下降,并且电镜下线粒体超微结构发生异常改变。高糖刺激24h后ERK1／2磷酸化蛋白量增加,并且磷酸化ERK1／2表达于细胞核内。高糖刺激24h后Muller细胞内AP-1 DNA结合活性升高,Real-time显示c-Fos和c-Jun mRNA表达量也升高(P<0.05)。Real-time PCR显示VEGFmRNA在高糖刺激后升高,并且在24h表现为高峰。ELISA显示VEGF浓度在高糖刺激后升高,并且在24h表现为高峰(P<0.05)。讨论：1)高糖刺激可致体外培养Muller产生氧化应激损伤；2)高糖刺激24h,Muller细胞内ERK1／2—AP1信号通路激活；3)高糖刺激后,Muller细胞分泌VEGF增多,高于正常对照组,而且在24h表现为高峰期。第三部分分别干预氧化应激及拮抗ERK1／2信号通路对VEGF分泌的作用目的：研究1)干预氧化应激对高糖环境下Muller细胞内ERK1／2信号通路以及VEGF分泌的作用；2)拮抗ERK1／2信号通路对高糖环境下Muller细胞VEGF分泌的作用。方法：1)高糖30mM刺激Muller细胞24h,同时给予抗氧化剂NAC干预(10mM,5mM), Western-blot研究ERK1／2磷酸化蛋白表达, EMSA研究AP-1DNA结合活性,Real-time PCR及ELISA检测VEGF mRNA含量及蛋白浓度。2)高糖30mM刺激Muller细胞同时,给予ERK1／2特异性抑制剂U0126(0.5mM,0.1mM)干预, Western-blot方法研究ERK1／2磷酸化蛋白表达,EMSA方法研究AP-1DNA结合活性,Real-timePCR及ELISA检测VEGF mRNA含量及蛋白浓度。结果：1)NAC抗氧化干预后,Western-blot检测显示干预组磷酸化ERK1／2蛋白表达量较非干预组下降,并与剂量间存在相关性(P<0.05)。EMSA检测显示NAC干预组AP-1滞后条带灰度值低于非干预组,提示DNA结合活性下降,并与剂量间存在相关性(P<0.05)。ELISA检测显示NAC干预组VEGF分泌量较非干预组下降,并与剂量间存在相关性(P<0.05)。Real-time PCR检测显示NAC干预组VEGF mRNA较非干预组下降,并与剂量间存在相关性(P<0.05)。2)U0126干预后Western-blot检测显示干预组磷酸化ERK1／2蛋白表达量较非干预组下降,并与剂量间存在相关性(P<0.05)。EMSA检测显示U0126干预组AP-1滞后条带灰度值低于非干预组,提示DNA结合活性下降,并与剂量间存在相关性(P<0.05)。ELISA检测显示U0126干预组VEGF分泌量较非干预组下降,并与剂量间存在相关性(P<0.05)。Real-time PCR检测显示U0126干预组VEGFmRNA较非干预组下降,并与剂量间存在相关性(P<0.05)。讨论：抗氧化应激可下调高糖环境下Muller细胞ERK1／2信号通路的激活,并减少VEGF的分泌；拮抗ERK1／2信号通路可减少高糖环境下Muller细胞VEGF的分泌。全文总结：糖尿病大鼠模型视网膜存在氧化应激→ERK1／2→AP1信号通路的激活,并且该通路与体内VEGF的分泌有着相关性。通过体外模拟糖尿病环境,并以Muller细胞为研究对象证实氧化应激→ERK1／2→AP1信号通路参与了分泌VEGF的机制。