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磷脂肌醇3-激酶(phosphatidylinositide-3kinase,PI3K)-蛋白激酶B(proteinkinaseB,PKB,又称Akt)-哺乳动物雷帕霉素靶体蛋白(mammaliantargetofrapamycin,mTOR)信号通路控制着众多在肿瘤发生发展中至关重要的细胞生物学过程,包括细胞增殖、凋亡、转录、翻译、代谢、新生血管生成以及细胞周期的调控。近年的研究表明,PI3K信号通路的功能异常与肿瘤的发生发展有着密切的关系,并被确认为是一个充满前景的抗肿瘤靶点。目前,世界上许多研究院所和医药公司都纷纷致力于针对该信号通路的激酶抑制剂的研究和开发,有一批化合物已经进入了临床Ⅰ/Ⅱ期的研究,并显示出良好的应用前景。基于未来高通量筛选该类抑制剂的潜在需求的考虑,本研究建立了PI3K激酶抑制剂的细胞筛选模型,并为分子筛选模型建立的可行性提供了方案。同时,在化学定向合成和修饰的化合物中,我们利用已经建立的细胞筛选模型初步筛选获得了活性较高的PI3K激酶抑制剂,并对其抑制PI3K及其他相关激酶(包括mTOR)活性以及抗肿瘤增殖作用和机理进行了深入研究。
根据之前的研究表明Crp1-PH结构域在分子和细胞水平,都能特异性地识别PtdIns(3,4,5)P3,而不能与PtdIns(4,5)P2结合。因此,我们首先利用该结构域的结合能力的特异性,建立了PI3K激酶抑制剂的细胞筛选模型。我们构建了稳定表达pEGFP-Grp1-PH融合蛋白的中国仓鼠卵巢癌细胞(CHO-K1),并验证了IGF-Ⅰ浓度和Grp1-PH膜转位现象的关系。通过对已知的PI3K激酶抑制剂的检测,我们进一步确证了该细胞模型对于PI3K激酶抑制剂筛选的特异性和灵敏性。目前运用该模型已经对PI3K抑制剂定向化学合成的57个(4种系列)化合物进行了筛选,得到了结果呈阳性的化合物,并在分子和细胞水平上进行了验证。
在建立细胞筛选模型的同时,我们也试图为基于分子水平的PI3K激酶抑制剂的高通量筛选寻找合适的技术方法。PI3K激酶抑制剂高通量筛选的发展一直受限于放射性元素的运用。为了克服放性污染的缺点并保证未来高通量筛选的适用性,我们选择利用荧光偏振(FluorescencePolarization,FP)的方法,提出了PI3K激酶抑制剂分子筛选模型的方案并初步验证了它的可行性。我们首先利用分子克隆的方法构建了GST-Grp1-PH重组原核表达质粒pGEX-Grp1-PH,并转化到大肠杆菌BL21中,通过IPTG诱导表达重组融合蛋白,并经过GST亲和柱层析和浓缩后得到高纯度的目标蛋白。利用蛋白-脂质覆盖方法(ProteinLipidOverlayApproach)验证了该蛋白能与PtdIns(3,4,5)P3特异地结合。利用FP的实验方法,我们研究了GST-Grp1-PH的浓度、荧光示踪剂的浓度、PI3K激酶浓度和反应时间及底物PtdIns(4,5)P2的浓度的关系。最后,用PI3K激酶抑制剂wortmannin初步检验了该模型的可行性。但是,该模型最终的高通量筛选运用和参数优化,还有待于PI3K激酶在真核细胞中自主表达的技术实现。
基于细胞筛选模型的建立,我们结合了定向合成、活性测定比较和分子对接模拟,筛选得到了PI3K/mTOR双重靶向激酶抑制剂WJD008。WJD008具有直接抑制重组表达纯化的PI3K(IC50=1.72±0.66nM)和免疫沉淀(Immunoprecipitation)获得的mTOR催化活性的能力(0.1μM和10μM的抑制率分别为64.47％和82.14％),而并非仅仅通过影响上游分子来抑制下游的激活。所以,我们认为WJD008是一种PI3K/mTOR双重靶向激酶抑制剂。
由于共济失调毛细管扩张突变激酶(AtaxiaTelangiectasiaMutated,ATM)、ATM与Rad3相关蛋白(ATM-andRad3-related,ATR)和DNA依赖性蛋白激酶(DNA-dependentproteinkinase,DNA-PK)具有与PI3K高度同源的催化结构域并同属于磷脂酰肌醇-3激酶相关的激酶家族(phosphatidylinositol-3kinase-relatedkinase,PIKK)成员,我们检测了WJD008对该类激酶的潜在作用。通过蛋白免疫印迹(Westernblot)的方法,我们发现WJD008逆转了由喜树碱(Camptothecin,CPT)诱发的DNA双链断裂所引起的γ-H2AX的上调(当浓度为40μM时已全部逆转)。这一现象提示,WJD008对于ATM、ATR和/或DNA-PK的激酶活性也具有潜在的抑制作用。
我们进一步检测了不同浓度的WJD008对于肿瘤细胞中PI3K-mTOR介导的信号通路的影响。我们发现WJD008能够有效对抗IGF-Ⅰ引起的该信号通路的激活,包括Akt、mTOR、p70核糖体S6激酶(p70S6K)和起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1)的磷酸化水平的下调,但是3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)的磷酸化水平变化不明显。这一现象在Rh30和PC-3两株肿瘤细胞中呈现了相同趋势的效应。
为了进一步确定WJD008是否直接影响细胞内PtdIns(3,4,5)P3的水平从而导致PI3K介导的信号通路的下调,我们利用荧光成像方法检测WJD008对PtdIns(3,4,5)P3招募Grp1-PH蛋白结构域到细胞膜这一过程的影响。我们发现WJD008显著抑制了稳定表达EGFP-Grp1-PH的CHO-K1细胞在IGF-Ⅰ刺激下的Grp1-PH结构域膜转位。由于Grp1-PH结构域能特异性地与PtdIns(3,4,5)P3结合,所以该现象直接反应了WJD008导致细胞内PtdIns(3,4,5)P3水平的下调,即PI3K的激酶活性受到了抑制。
由于PI3K-Akt-mTOR信号通路与RNA转录以及蛋白质合成的关系密切,一旦该信号通路被阻断,就会发生细胞周期G1期阻滞。为了检测WJD008是否也能通过影响该信号通路从而引起周期阻滞,我们采用了流式细胞术(FACS)。结果发现,当WJD008作用于Rh30细胞时,该细胞呈现出时间和浓度依赖性地G1期阻滞。
目前的临床数据已表明,许多癌症的发生发展与PI3K激酶的突变引起的该信号通路的高度持续活化有着紧密的联系。其中,H1047R是编码p110α催化亚基PIK3CA的一个突变热点。所以,我们检测了WJD008对于突变PI3K引起的信号通路的持续激活的影响以及增殖的抑制作用。实验结果发现,在稳定表达PIK3CAH1047R突变基因的RK3E细胞中,WJD008能下调PI3K介导的信号通路的活化水平。与泛PI3K激酶抑制剂wortmannin不同的是,WJD008表现出了与对于RK3E细胞株的增殖和克隆形成抑制能力相当的活性。
由于WJD008能引起肿瘤细胞周期的G1期阻滞并且对PI3K野生型和突变型细胞中的PI3K-mTOR介导的信号通路具有下调作用,我们进一步检测了该化合物对于肿瘤细胞增殖的影响。我们发现,WJD008对于17株不同组织来源的肿瘤细胞的增殖有一定的抑制能力。特别地,对于因不同因为而导致PI3K-Akt-mTOR通路高度活化的的Rh30、PC-3和HCT-116细胞,WJD008的增殖抑制能力IC50均小于10μM。这些现象均提示,不论PI3K-Akt-mTOR信号通路以何种方式(包括通过上游受体酪氨酸激酶、同水平的PTEN功能缺失以及PI3K的功能性突变)被激活,WJD008的作用都能产生相类似的增殖和克隆形成抑制能力。
综上所述,本研究建立了PI3K激酶抑制剂的细胞筛选模型,并提出了分子筛选模型的初步方案。同时,通过定向化学合成和活性比较,利用细胞筛选模型,我们筛选得到PI3K/mTOR双重靶向激酶抑制剂WJD008并对其抗肿瘤作用和机制进行了研究。可以预见地,这些工作都会为将来建立完整的PI3K激酶抑制剂高通量筛选平台和加快新药发现,提供了方法学上的有利支持。