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小G蛋白(Small GTPases)是一类重要的信号蛋白,它们和G蛋白α亚基同源,具有GTP酶活性和GDP/GTP结合部位,可以单独结合GTP并使其水解成GDP,实现对下游效应蛋白的调控。目前,丝状真菌中报道的小G蛋白主要有Ras、Rho、Rab和Arf等5个蛋白家族。捕食线虫真菌通过产生特殊的捕食器官(Trapping devices)捕获线虫,在杀死线虫的同时获得生长所需要的营养物质。捕食器官不仅作为捕获线虫的武器,同时也是真菌从腐生转变为寄生的重要标志,然而其形成的信号调控机制知之甚少。寡孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)是捕食线虫真菌的代表性菌种,本论文以该真菌为实验菌株,以Rab和Arf小G蛋白AoRab-7A(AOL_s00054g446)、AoRab-2(AOL_s00054g360)、AoArf-GAP(AOL_s00054g68)和AoArl(AOL_s00215g117)为研究对象,利用基因敲除等分子生物学技术,初步探究了Rab和Arf小G蛋白在寡孢节丛孢生长发育、捕食器官形成和致病过程中的功能。主要实验结果:1.4个小G蛋白的氨基酸序列和聚类分析对寡孢节丛孢4个小G蛋白的氨基酸序列和蛋白功能结构域进行分析,除AoArf-GAP的分子量较大,含有476个氨基酸外,其它3个小G蛋白的分子量相相对较小,都只有200多个氨基酸,同时AoArf-GAP蛋白的功能结构域与其它3个小G蛋白不同,AoArf-GAP的功能结构域主要包括锌指结构域(IPR037278)和Arf GTPase激活蛋白结构域(IPR001164),而其它3个小G蛋白都含有包含P环的核苷三磷酸结构域(IPR027417)和小G蛋白结合结构域(IPR005225)。聚类分析表明,AoRab-7A和AoRab-2聚类于两个不同的进化分支,类似的AoArf-GAP和AoArl也聚类于两个不同的进化分支,推测Rab和Arf家族的两个成员在寡孢节丛孢中可能分别发挥不同的功能。2.小G蛋白编码基因的敲除及表型研究利用同源重组的方法,成功获得了4个小G蛋白编码基因的敲除突变菌株,并对它们的表型特征进行了比较,包括菌落形态、生长速率、捕器的形成和数量、孢子数量和形态及胞外蛋白酶的活性等。结果发现ΔAoRab-7A突变株的生长速率比野生型菌株慢且气生菌丝较弱,产孢数量显著降低,并且不能产生三维菌网捕器,胞外蛋白酶的活性下降。ΔAoArf-GAP突变株生长速率比野生型菌株慢且菌落呈不规则状,产孢能力也显著降低,产生畸形的孢子,捕食器官数量减少。而ΔAoRab-2和ΔAoArl突变株与野生型菌株相比表型无明显变化。3.ΔAoRab-7A和ΔAoRab-2突变株部分表型相关基因的定量分析收取不同培养时间的ΔAoRab-7A和ΔAoRab-2突变株和野生型菌株样品,提取总RNA,反转录成cDNA。选取与产孢、抗逆性以及胞外蛋白酶等表型差异相关的部分基因进行RT-PCR分析,在ΔAoRab-7A突变株中,产孢、抗逆性和胞外蛋白酶相关基因的转录水平相对野生型菌株有较大的变化,说明该蛋白参与寡孢节丛孢的产孢、抗逆性和致病性等生物学过程的调控。而在ΔAoRab-2突变株中,各基因的转录水平变化都不是很明显,与表型的差异基本一致。4.AoRab-7A蛋白参与寡孢节丛孢自噬小体的形成在氮饥饿条件下,我们对ΔAoRab-7A突变株和野生型菌株进行自噬小体染色实验,结果表明AoRab-7A的突变严重阻碍了寡孢节丛孢自噬小体的发生,说明AoRab-7A蛋白参与寡孢节丛孢自噬小体的形成。本文的创新点:1.成功敲除了4个小G蛋白的编码基因,发现AoRab-7A和AoArf-GAP参与寡孢节从孢生长、产孢和捕器形成等重要生物学过程的调控。2.比较了部分产孢、抗逆性以及丝氨酸蛋白酶等相关基因在寡孢节丛孢和ΔAoRab-7A突变菌株中的转录水平变化,推测AoRab-7A参与寡孢节丛孢部分产孢、抗逆性以及胞外蛋白酶编码基因的表达调控。3.证实AoRab-7A蛋白参与寡孢节丛孢氮饥饿条件下自噬小体的形成。