目的:通过构建携带热休克蛋白90α功能性F-5基因的慢病毒载体,并用慢病毒转染人脐带间充质干细胞,来探索热休克蛋白90α功能性F-5基因结合人脐带间充质干细胞对糖尿病大鼠慢性创面的治疗效果,并验证其有效性,为治疗糖尿病慢性创面提供新的有效的治疗手段及方法,为临床上应用休克蛋白90α功能性F-5基因表达产物治疗糖尿病创面提供新的思路。方法:1、携带热休克蛋白90αF-5基因的过表达慢病毒载体的制备、病毒包装与滴度检测:首先需要构建携带目的基因的载体质粒,可以选择含有绿色荧光蛋白基因和抗药物筛选基因的工具载体GV358,将事先经过PCR扩增的目的基因片段交换入线性表达载体,并在感受态细胞中完成转化,最终获取质粒。获取质粒后进行阳性克隆PCR鉴定,用以确定质粒含有目的基因片段;并用蛋白印迹法检测质粒的目的基因是否能正常表达对应蛋白。上述制备好的工具载体质粒GV358与辅助质粒Helper1.0、Helper2.0一起,转染293T细胞,完成病毒的包装。通过反复离心的方式收获病毒、浓缩纯化病毒;并用通过观察物理指标、滴度指标,对病毒质量进行检测。2、携带F-5基因慢病毒转染人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）:原代培养,标准方法传代,选择5代以内进行下一步实验。在正式转染之前,需要确定最合适细胞接种密度,最佳嘌呤霉素筛选浓度,最佳感染复数MOI值。按照上述最佳转染条件进行转染:转染前1天,在6孔板中按8×10⁴/孔的密度接种,当细胞融合度达40%左右时,按照MOI=8加入含病毒液的完全培养基1ml。8小时后,去除含有病毒的培养液,加入完全培养液。24小时后,向各孔中并加入含嘌呤霉素3μg/ml的完全培养液。待筛选药物作用6天后,取出细胞培养板置于荧光显微镜下观察慢病毒转染效率。转染后需要检测干细胞免疫表型,观察转染后干细胞是否保持原来属性。然后将转染后的干细胞分三组:A组:携带F-5基因的慢病毒转染hUC-MSCs组;B组:空载慢病毒转染hUC-MSCs组;C组:未转染的稳定hUC-MSCs组（空白对照组）。分组进行如下检测:通过荧光定量PCR检测F-5基因表达;通过CCK-8法（Cell Counting Kit-8试剂盒检测方法）检测细胞增殖能力;用细胞划痕实验检测细胞迁移能力。3、糖尿病大鼠的制备及全层皮肤缺损模型的制备:采用经典的腹腔注射0.2%链脲佐菌素（STZ）的方法建模,并于建模后第3天、第7天为时间点测定随机血糖,拟定血糖≥16.7mmol/L为造模成功。建模后的大鼠继续饲养1周,制备创面模型。选取脊柱两侧旁开1cm分别做直径16mm圆形创面,面积为2.00cm²,按标线用标准外科方法切除全层皮肤、皮下结缔组织,至深筋膜。并将事先灭菌的特制不锈轻便金属环缝合于创面上。背部打孔为两个。术后第二天开始进行下一步实验。4、设计实验分组:A组:携带F-5基因慢病毒转染人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）组;B组:空载慢病毒转染hUC-MSCs组;C组:hUC-MSCs组。将90只大鼠随机分为3组,每组30只,分别入组A、B、C组,每组大鼠背部有两个孔,随机选择1个为干预孔（A、B、C组）,另一个为自身对照孔。按照分组对创面进行干细胞注射:A、B、C组分别将对应的干细胞制成浓度为4×10⁵/ml的细胞悬液,每个创面中央注射0.15ml悬液,层次位于深筋膜下,并于24小时后重复注射治疗一次;空白对照孔无特殊处理;治疗完毕后所有创面无菌双层油纱覆盖并妥善固定。5、糖尿病大鼠创面干细胞治疗后各项指标测定:（1）随机血糖的测定:建立糖尿病大鼠模型（腹腔注射链脲佐菌素）,血糖监测点定在第0、7、14天,创面建模后血糖监测点定在术后第7、14、21天。（2）糖尿病大鼠全层皮肤缺损创面模型一般情况观察:从颜色、创缘深度、肉芽生长情况、分泌物情况、表皮生长情况等各个方面对创面进行描述。（3）检测创面面积、创面愈合率的变化:创面制作后第0、3、7、14、21天用数码相机拍摄创面,每个创面重复拍摄并测定3次,选取平均值作为最终面积。采用Image I医学图像分析软件对照片进行分析,计算出糖尿病大鼠的创面面积。（4）创面愈合率等于创面初始面积减去创面治疗后面积除以创面初始面积。分别计算出伤后3、7、14、21天的创面愈合率。（5）创面组织HE染色:首先制作石蜡切片,然后用HE染色方法制作病理切片,并观察创面组织结构情况以及创面愈合过程中炎症细胞、成纤维细胞、毛细血管分布、细胞外基质胶原情况。（6）免疫组织化学染色法测定VEGFR ₂、eNOS:制作石蜡切片后,用免疫组化试剂盒顺序操作的步骤制作切片,阳性表达信号为胞浆或胞膜上出现的棕黄色颗粒,用平均光密度值来估计各因子的表达情况（半定量的方式）。6、统计学分析:运用GraphPad Prism 5.0和SPSS18.0统计软件对实验数据及资料进行统计学分析。实验数据均用均数±标准差表示,两组以上数据组间比较应用多因素方差分析,组内比较采用t检验,两组以上率的比较应用Fisher检验,检验水准α=0.05,当P<0.05时,认为差异具有统计学意义。结果:1、慢病毒质粒构建结果:经PCR扩增后,获取长度为392bp的目的基因HSP90AA₁片段,与理论值相符合。目的基因交换入线性化表达载体后PCR电泳可见产物大小为540bp,且各组电泳条带均与理论值符合。病毒阳性克隆测序结果显示目的基因成功插入GV358质粒中。携带目的基因的质粒转染293T细胞后,可以观察到细胞发出绿色荧光,显示质粒转染成功。Western Blot法检测出转染成功的293T细胞中目的基因产物大小为15KD,可以成功过表达。2、慢病毒包装结果:收获的携带F-5基因的慢病毒原液LV-HSP90AA₁（14688-1）通过正常自然光下观察,为粉红色澄清液体。荧光滴度及药物筛选法测定出的平均病毒滴度均为2.00×10⁸（TU/ml）。3、人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）长梭形或长多角形的形态,集簇排列,贴壁生长,圆形或椭圆形细胞核位于细胞中央,胞质丰富均匀。5代以内的hUC-MSCs增值率在不同检测时间点490nm处吸光光度值（OD）无统计学差异。4、最佳转染效率MOI值为8。慢病毒转染后人脐带间充质干细胞生长状态与转染之前类似,只是细胞质较转染前丰富。转染后48小时内,无荧光现象。转染72小时后,开始出现绿色荧光。转染96小时后,细胞荧光强度较高,对绿色荧光细胞计数,通过计算转染率约在97%-98%左右。流式细胞仪检测结果显示,慢病毒转染干细胞后,免疫表型表达与国际细胞移植学会要求相符。5、转染后细胞活性:在培养12小时、1天时,3组细胞间的增值率无统计学差异（P>0.05）。而在第3、5、7天时,A组、B组与C组3组间差异具有统计学意义（P<0.05）。第3天时,C组与A组,C组与B组间的增值率差异具有统计学意义（P<0.01）。而A组与B组间差异无统计学意义（P>0.05）。第5天时,C组与A组,C组与B组间增值率的差异均具有统计学意义（P值<0.01）。A、B两组差异无统计学意义（P>0.05）。在第7天时,C组与A、B两组分别比较,P值均<0.05,两组间差异均具有统计学意义,但A、B两组间的增殖率差异无统计学意义（P>0.05）。6、荧光定量PCR可以检测到A组F-5基因表达相对含量为0.753,B组为0.212,C组为0.217。7、细胞划痕实验结果显示在6、12、18小时,A组与B组、C组（干细胞组）相比均有显著统计学意义,B组与C组在上述时间点无统计学意义。8、注射STZ及制造大鼠背部创面模型后的整个实验过程中,大鼠血糖水平均在16.7mmol/L,在各检测时间点各组大鼠血糖水平差异无统计学意义。9、创面一般情况观察发现:A组创面在整个愈合过程中,始终保持较快的生长速度,创面颜色红润,肉芽生长快,组织肿胀轻,分泌物少,上皮覆盖快。B组、C组肉眼观察生长情况类似,但明显比A组愈合慢。整个过程中,最差的是空白对照孔,炎症反应重,分泌物多,上皮覆盖慢。10、创面愈合情况:在创面愈合面积、愈合率方面,各组随着时间都存在愈合趋势;A组在第3、7、14、21天时与其他组相比,创面面积缩小,有统计学意义（P<0.05）。B组与C组在各时间点无统计学意义（P>0.05）,但与空白对照比较,创面面积减小,具有统计学意义（P<0.05）。创面愈合时间方面,A组与其他各治疗组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。B组和C组相比,无统计学意义（P>0.05）,但均比空白对照愈合时间短（P<0.05）。11、通过对HE染色切片的观察发现,A组切片在各个时间点炎症细胞均浸润相对较少,新生血管生长早且旺盛,成纤维细胞聚集量相对较大,细胞外基质胶原沉积较多,且排列相对紧密。B组、C组组织学差异不明显,与A组相比各项指标均落后;空白对照组最差,炎症细胞聚集量大,经久不退,成纤维细胞及胶原含量少,排列无规则。12、免疫组织化学染色法观察发现VEGFR2、eNOS在伤后3天时,A组的表达明显高于其他3组（P<0.05）,其余3组间表达差异无统计学意义。而在伤后7、14、21天时,A组表达高于B组及C组组（P<0.05）,B组与C组又高于空白对照组（P<0.05）,但B组与C组间差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.成功构建携带热休克蛋白90α功能性F-5基因以及绿色荧光、抗药筛选基因的慢病毒载体。2.构建的慢病毒载体成功的转染人脐带间充质干细胞,并不影响干细胞的免疫表型,增殖率略有下降。3.携带热休克蛋白90α功能性F-5基因的慢病毒转染后的人脐带间充质干细胞可以过表达F-5基因产物,有效的缩短糖尿病大鼠慢性创面的愈合时间,提高创面愈合率。