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引言胃癌是临床最常见的恶性肿瘤之一,化疗是中晚期胃癌的主要治疗方法,然而,由于肿瘤多药耐药(multidrug resistance,MDR)的产生,常常导致化疗的失败,MDR已成为胃癌化疗失败的主要原因之一,因此,深入研究胃癌MDR机制和克服方法,将有可能带来胃癌治疗新突破。蛋白质是细胞生命活动及其功能的主要执行者,直接从蛋白质整体水平来研究肿瘤MDR的产生机制、筛选耐药相关蛋白对于揭示肿瘤MDR无疑具有重要价值。蛋白质组学作为后基因组时代研究的一个重要内容,为生命科学提供一个新的研究平台,同时为肿瘤MRD的研究带来新的思维方式和研究领域,将有可能对肿瘤的MRD机制的研究带来新的突破,此前本课题组应用差异蛋白质组学技术对人胃癌细胞株SGC7901和阿霉素耐药细胞SGC7901/ADR进行蛋白差异比较,应用高效液相色谱电喷雾电离串联质谱(high-perfomance liquid chematography electropray ionization mass spectrometry/mass spectrometry, HPLC-ESI MS/MS)方法对部分差异蛋白进行分析,结果发现人类S100钙结合蛋白All (S100 calcium binding protein All, S100A11)、肽脯异构酶(Peptidylprolyl cis-trans isomerase Pinl)在SGC7901中呈高表达,在SGC7901/ADR细胞中表达下调。为进一步验证质谱分析结果,本实验应用免疫细胞化学、Western-blot方法和RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction)技术从蛋白质和基因水平检测S100A11、Pin1在SGC7901和SGC7901/ADR中的表达情况。目的验证人胃癌细胞株SGC7901和SGC7901/ADR中S100A11、Pin1的差异表达,为进一步探讨S100A11和Pin1与胃癌MDR的关系及为基因转染和RNA干扰奠定基础。方法将人胃癌SGC7901细胞和SGC7901/ADR细胞进行传代培养,分别接种在置于6孔板的盖玻片上正常培养过夜,应用免疫组化MaxVisinTM方法染色,观察S100A11和Pinl在两种细胞株中的差异表达,S100A11兔抗人多克隆抗体、Pinl兔抗人多克隆抗体(购置美国ProteinTech Group, Inc, Max VisinTM购置福州迈新生物技术开发有限公司),兔抗人S100A11多克隆抗体1：100稀释；兔抗人Pinl多克隆抗体1：50稀释。人胃癌SGC7901细胞和SGC7901/ADR细胞进行传代培养,收集细胞；用RIPA裂解液提取SGC7901和SGC7901/ADR细胞总蛋白,考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,RNAiso Reagent裂解液分别提取两种细胞总RNA,用Western-blot和RT-PCR方法分别从蛋白质水平和mRNA水平对S100A11及Pinl在SGC7901和SGC7901/ADR细胞中的表达进行检测和分析。结果1.免疫细胞化学染色结果,S100A11和Pinl在SGC7901细胞中呈高表达。S100A11免疫细胞化学染色定位在细胞浆中,SGC7901细胞胞浆染色呈棕黄色-棕褐色,染色结果为强阳性(+++),在SGC7901/ADR细胞中表达量明显下降,胞浆染色呈淡黄色,染色为弱阳性(+)；Pinl免疫细胞化学染色定位为胞浆胞膜型,SGC7901细胞胞浆胞膜着色呈黄色,染色结果为强阳性(++)；在SGC7901/ADR细胞中表达量明显降低,呈淡黄色,染色为弱阳性(+)。2. Western-blot免疫印迹结果,提取SGC7901和SGC7901/ADR细胞总蛋白, SGC7901细胞总蛋白浓度为3.5ug/ul, SGC7901/ADR细胞总蛋白浓度为3.2ug/ul。S100Al l在SGC7901细胞中蛋白平均表达量0.69±0.13,明显高于SGC7901/ADR细胞平均表达量0.22±0.08,经两个独立样本的t检验,P<0.05,两者具有显著性差异,表明S 100A1 1在SGC7901细胞中呈高表达,Pinl在SGC7901细胞中蛋白平均表达量0.81±0.15,明显高于SGC7901/ADR细胞平均表达量0.52±0.09,P<0.05,经两个独立样本的t检验,两者具有显著性差异,表明Pinl在SGC7901/ADR细胞中表达下调。3. RT-PCR结果,S100A11、Pinl在SGC7901细胞和SGC7901/ADR细胞中基因mRNA表达,结果显示S100A11和Pinl在两种细胞株中差异不具有显著性。在SGC7901细胞中S100A11基因总mRNA平均表达量为0.60±0.87,在SGC7901/ADR细胞中基因的1mRNA平均表达量为0.59±0.78,经两个独立样本t检验,P>0.05,无显著性差异。在SGC7901细胞中Pinl基因mRNA平均表达量为1.49±0.13,在SGC7901/ADR细胞中基因mRNA平均表达量为1.41±0.16,经两个独立样本t检验,P>0.05,无显著性差异。结论1. S100A11和Pinl蛋白在人胃癌细胞SGC7901及其耐药细胞SGC7901/ADR中存在差异表达,S100Al1和Pinl蛋白在SGC7901细胞中呈高表达,而在SGC7901/ADR细胞中呈低表达。2.SGC7901细胞中S100A11和Pin1的mRNA含量与耐药细胞SGC7901/ADR中含量无明显差异,这两种蛋白在SGC7901细胞和SGC7901/ADR细胞中的差异表达不是SGC7901细胞合成增加或SGC7901/ADR细胞合成减少结果,而是合成后事件,可能与SGC7901细胞S100All和Pin1蛋白降解减少或SGC7901/ADR细胞降解增多有关。3.S100A11、Pinl在SGC7901细胞和耐药株SGC7901/ADR细胞中差异表达,可能与胃癌MDR有关。