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中华鳖(Pelodiscus sinensis)隶属爬行纲(Reptilia),龟鳖目(Testudines)。中华鳖雄性个体较雌性大,生长速度快,裙边宽厚,营养丰富以及市场单价高,更受行业和消费者喜爱,因而中华鳖全雄苗种培育对中华鳖养殖业具有重大意义。探究其性别决定和分化是实现这一目标的关键,而Rspo1、Wnt4和Beta-catenin1是雌性性别决定和分化的重要调控因子。本研究克隆了中华鳖Wnt4基因的c DNA全长,分析Rspo1、Wnt4和Beta-catenin1在中华鳖雌雄成鳖组织、不同发育时期胚胎的表达特征以及Wnt激动剂和Wnt/β-catenin抑制剂诱导后基因表达特征。主要研究如下:1、本研究克隆获得了中华鳖Wnt4基因c DNA全长序列,全长为2432 bp,开放阅读框为1095 bp,编码364个氨基酸,5′-UTR 48 bp和3′-UTR 1289 bp。Wnt4蛋白的分子量为40.36 k D,理论等电点9.04,其具有24个Wnt蛋白家族重要的半胱氨酸保守序列。中华鳖Wnt4基因与海龟和墨西哥箱龟的同源性最高,高达91.7%。系统发育表明,Wnt4蛋白聚为三支:哺乳动物和爬行动物聚为一大支、硬骨鱼类聚为一支、贝类聚为一支。中华鳖Wnt4与海龟、墨西哥箱龟和美洲短吻鳄等爬行动物聚在一起,与海龟和墨西哥箱龟亲缘关系最近,与栉孔扇贝亲缘关系最远。2、q RT-PCR的方法检测Rspo1、Wnt4和Beta-catenin1的表达,对在成鳖组织、不同发育时期胚胎以及Wnt激动剂和Wnt/β-catenin抑制剂诱导后的表达特征进行了分析。(1)在成鳖组织中的表达特征中华鳖Wnt4在成鳖的脑、性腺、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、肠和肌肉组织均有表达,具有一定的组织差异性,在性腺中的表达最高,在脑和肺组织中其次,在肠组织中表达量最低,雌性卵巢表达显著高于雄性精巢(P<0.05)。Beta-catenin1表达也呈现广泛性,且有一定的组织差异性,在脑和性腺中的表达显著高于其他组织(P<0.05)。中华鳖Wnt4和Beta-catenin1基因可能参与了多种生物学过程,尤其是在性腺发育或功能维持中起关键作用。(2)不同发育时期胚胎中的表达特征Rspo1、Wnt4和Beta-catenin1基因在胚胎发育第14期～21期均有表达。Rspo1基因在雌性胚胎中的表达整体上升,在雄性胚胎中的表达整体下降。在第14期已经有表达,并且在第15期～21期表达逐渐上升,在雌性胚胎中表达持续高于雄性(P<0.05),在第19期、20期和21期雌性胚胎中的表达极显著高于雄性(P<0.01);Wnt4基因在雌性胚胎中表达逐渐增加,在雄性胚胎中维持在较低的表达水平,在第14期已经有表达,雌性胚胎中的表达明显高于雄性(P<0.05),在第15期～21期始终维持雌性高表达,在第20期和21期雌性胚胎中的表达极显著高于雄性(P<0.01);Beta-catenin1基因在胚胎中的表达为先上升再下降,在第14期已有表达,第14期～16期表达逐渐增加,第16期表达达到最大,在第18期和21期雄性胚胎中的表达显著高于雌性(P<0.05)。以上实验表明Rspo1、Wnt4和Beta-catenin1可能参与了胚胎发育过程,对中华鳖性腺分化发挥关键作用。(3)Wnt激动剂对基因表达的影响Wnt激动剂对Rspo1基因表达的影响:在第15 d用Wnt激动剂处理中华鳖胚胎,在雌性胚胎中,1?g/?L处理后,Rspo1在36 h～168 h表达上调,在72h达到峰值;2.5?g/?L处理后,在12 h～168 h表达上调,72 h达到峰值;而5?g/?L处理后,在6 h～168 h表达显著上调(P<0.05),48 h达到峰值。在雄性胚胎中,1?g/?L处理后,Rspo1在48 h～168 h表达上调,在72 h达到峰值;2.5?g/?L处理后,在36 h～168 h表达上调,在72 h达到峰值;而5?g/?L处理后,在6 h～168 h表达上调,72 h达到峰值。Wnt激动剂对Wnt4基因表达的影响:在雌性胚胎中,1?g/?L处理后,Wnt4在36 h～96 h表达上调,72 h达到峰值,120 h～168 h恢复正常表达水平;2.5?g/?L和5?g/?L处理后,在24 h～168 h表达上调,72 h达到峰值。在雄性胚胎中,1?g/?L处理后,Wnt4在6 h～36 h表达显著上调(P<0.05),36 h达到峰值,48 h～168 h表达逐渐下调;2.5?g/?L处理后,在6 h～96 h表达显著上调(P<0.05),96 h达到峰值,120 h～168 h恢复正常表达水平;而5?g/?L的处理后,6 h～168h表达显著上调P<0.05),96 h达到峰值。Wnt激动剂对Beta-catenin1基因表达的影响:在雌性胚胎中,1?g/?L处理后,Beta-catenin1在36 h～168 h表达上调,72 h表达达到峰值;而2.5?g/?L和5?g/?L处理后,在6 h～168 h表达上调,72 h表达达到峰值。在雄性胚胎中,1?g/?L处理后,在24 h～168 h表达上调,48 h表达达到峰值;2.5?g/?L处理后,在6 h～168 h表达上调,48 h表达达到峰值;而5?g/?L处理后,6 h～168 h表达显著上调(P<0.05),72 h表达达到峰值。(4)Wnt/β-catenin抑制剂对基因表达的影响Wnt/β-catenin抑制剂对Rspo1基因表达的影响:在雌性胚胎中,1?g/?L处理后,Rspo1在6 h～48 h表达显著下调(P<0.05),72 h后恢复至正常的表达水平;2.5?g/?L处理后,在6 h显著下调表达,12 h后表达维持在正常的表达水平;而5?g/?L处理后,6 h～168 h表达上调。在雄性胚胎中,1?g/?L和2.5?g/?L处理后,在12 h～36 h表达显著下调(P<0.05);而5?g/?L处理后,6 h～168 h表达上调,72 h表达达到峰值。Wnt/β-catenin抑制剂Wnt4基因表达的影响:在雌性胚胎中,1?g/?L处理后,Wnt4从6 h～168 h表达下调;2.5?g/?L处理后,在6 h～120 h表达下调,144 h～168 h恢复至正常的表达水平;而5?g/?L处理后,在6 h～12 h表达下调,24 h～144 h表达上调,96 h表达达到峰值,168 h恢复至正常的表达水平。在雄性胚胎中,1?g/?L的处理后,在6 h～12 h维持在正常的表达水平,24 h～168 h表达显著下调(P<0.05);2.5?g/?L处理后,在6 h～24 h维持在正常的表达水平,36 h～168 h表达显著下调(P<0.05);而5?g/?L处理后,在6 h～168h表达上调,96 h表达达到峰值。Wnt/β-catenin抑制剂Beta-catenin1基因表达的影响:在雌性胚胎中,1?g/?L处理后,Beta-catenin1在6 h～48 h表达下调,72 h～96 h表达显著上调,120 h～168 h恢复至正常表达水平;2.5?g/?L处理后,在6 h～36h表达下调,72 h～168h表达显著上调(P<0.05);而5?g/?L处理后,在6 h～168 h表达显著上调(P<0.05),36 h表达达到峰值。在雄性胚胎中,1?g/?L处理后,在6 h～120 h表达下调,144 h～168 h恢复至正常的表达水平;2.5?g/?L处理后,在6 h～120h表达下调,144 h～168 h表达上调;而5?g/?L处理后,在6 h～168 h表达上调,36 h表达达到峰值。