噻唑烷二酮类药物(thiazolidinedione TZDs)如曲格列酮、罗格列酮和吡格列酮,主要应用于Ⅱ型糖尿病的治疗,具有缓解胰岛素抵抗,延缓糖尿病进展的良好疗效,然而肝脏毒性是困扰此类药物研发应用的一个重要问题[1]。曲格列酮在2000年因导致严重的肝毒性而在美国撤市[2]。2009年罗格列酮和吡格列酮在10年的药物使用不良事件报告中,也被指出具有一定的肝毒性[3,4]。噻唑烷二酮类药物家族仍有新的成员在研发中,但其肝毒性的发生机制仍未得到很好的阐明,虽然罗格列酮和吡格列酮的肝毒性已经较曲格列酮明显降低,但为何三种药物的毒性相差如此之大,它们致肝损伤的机制有何差异?目前还缺乏三种药物系统的毒性比较研究。众所周知,肝细胞中所富含的线粒体与肝脏的生物合成、代谢和解毒功能密不可分,同时在调节细胞内钙离子浓度、信息传递及细胞死亡等过程中发挥重要的作用;另一方面,众多具有心脏毒性、肾毒性、肝毒性和肌肉毒性的药物,也大多经由影响线粒体的结构或功能而诱发毒性[5]。过去曾报道过曲格列酮的线粒体毒性,但具体机制需要进一步研究。罗格列酮和吡格列酮对线粒体的影响与肝毒性的关系也需要得到阐明。在本研究中,我们使用了更加优良的人肝癌细胞株Hepa RG细胞为体外模型,在三种不同浓度的TZDs药物处理后,从细胞水平、亚细胞水平、代谢水平以及蛋白水平,全面研究线粒体毒性的特点和规律,分析三种药物毒性差异并探讨其发生机制。加深对此类药物的线粒体毒性认识,也为该类药物的肝脏毒性的深入研究提供思路,同时,为进一步建立和完善药物临床前期线粒体毒性的筛选体系提供依据。本研究分为以下四部分:1.噻唑烷二酮类药物对Hepa RG细胞增殖、凋亡以及细胞周期的影响目的测定Hepa RG细胞生长曲线,了解了Hepa RG细胞生物学特性和培养的基本参数,为后续试验奠定基础。研究并比较噻唑烷二酮类药物曲格列酮、罗格列酮和吡格列酮对Hepa RG细胞增殖、细胞周期及凋亡方面的影响,探讨其发生的可能机制。方法采用MTT法测量Hepa RG细胞生长曲线并检测药物对细胞增殖的影响,采用FITC Annexin V和碘化丙啶双染法,利用流式细胞仪,检测不同浓度的药物处理后细胞凋亡的情况。采用PI/RNase法,利用流式细胞仪,检测不同浓度的药物处理对细胞周期的影响。用western-blot检测凋亡相关蛋白Bax、caspase-3、Bcl-2的表达,探讨三种药物细胞毒性的作用机制。结果三种药物均对Hepa RG细胞的增殖有抑制作用,其中曲格列酮抑制能力最强,48小时的曲格列酮半数抑制浓度为50.44±2.12μM,罗格列酮LC50=64.75±3.66μM,吡格列酮LC50=68.2±3.01μM,。根据此试验结果,后续试验中,选择48小时为处理时间,药物的最高浓度均选择50μM。曲格列酮可导致一定程度的细胞凋亡,50μM组作用较明显,罗格列酮仅在高浓度组发生明显改变,吡格列酮组与对照组相比无明显差异。三种药物抑制细胞周期的影响强于对凋亡的影响,均可将导致细胞出现G0G1期阻滞。曲格列酮能明显的上调去促凋亡蛋白Bax、caspase-3的表达,同时对抗凋亡蛋白Bcl-2的表达有下调作用,具有明显的浓度依赖效应,50μM组最为明显。50μM罗格列酮对Bax、caspase-3有明显的上调作用,但对Bcl-2的表达没有明显影响。吡格列酮组的几种蛋白与对照组相比,未发生明显的变化小结三种噻唑烷二酮类药物均对Hepa RG细胞增殖有明显抑制效果,具有一定的时间浓度依赖关系:药物抑制增殖的主要原因是引起细胞发生G0G1期阻滞,曲格列酮和高浓度罗格列酮能够促使细胞发生凋亡。2.噻唑烷二酮类药物对Hepa RG细胞线粒体结构功能的影响目的研究并比较噻唑烷二酮类药物曲格列酮、罗格列酮和吡格列酮的线粒体毒性,探讨其发生的可能机制,为识别和防控此类药物的线粒体毒性提供指导。方法采用人肝癌细胞株Hepa RG为细胞模型,以12.5μM、25μM、50μM曲格列酮、罗格列酮和吡格列酮处理48小时。使用海马生物能量测定仪实时检测细胞的呼吸耗氧量、化学发光法检测ATP水平、流式细胞术检测ROS水平,使用RT-PCR法检测线粒体DNA含量变化、并测定线粒体复合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的活性,透射电镜观察线粒体超微结构改变等指标。结果噻唑烷二酮类药物可引起不同程度的呼吸功能紊乱,包括耗氧量下降、线粒体呼吸酶链复合体活性下降、ATP含量下降和ROS水平升高,其中曲格列酮效力最强,在低浓度即可发挥作用,罗格列酮次之,吡格列酮仅在高浓度产生明显的影响。此类药物还可导致mt DNA含量下降,与对照组(100%)相比,50μM曲格列酮组mt DNA表达下降(28±2)%,25μM曲格列酮组mt DNA表达下降(56±10)%(P<0.05),12.5μM曲格列酮组未观察到明显改变,罗格列酮和吡格列酮组仅高浓度产生明显效应,其中罗格列酮组mt DNA含量下降(81±6)%,吡格列酮组mt DNA含量下降(88±3)%(P<0.05)。曲格列酮处理可引起膜电位下降,与对照组相比,50μM组膜电位下降(33.1±1.3)%、25μM下降(45.9±1.29)%,12.5μM组下降(56.43±2.02)(P<0.01),罗格列酮和吡格列酮处理未观察到明显改变。电镜结果显示,50μM曲格列酮组出现线粒体肿胀和空泡化,25μM曲格列酮组出现线粒体断裂消失,12.5μM曲格列酮组线粒体嵴排列紊乱,罗格列酮和吡格列酮组仅高浓度发生明显改变,其损伤表现与25μM曲格列酮组类似。小结噻唑烷二酮类药物均具有一定的线粒体毒性,曲格列酮线粒体毒性最强,其发生机制可能与呼吸功能的紊乱、氧化应激以及线粒体内膜通透性改变而导致的线粒体结构功能改变相关。3.噻唑烷二酮类药物导致Hepa RG细胞氧化损伤及相关机制研究。目的系统地研究比较噻唑烷二酮类药物曲格列酮、罗格列酮和吡格列酮在导致细胞氧化损伤方面的作用特点,探讨其发生的可能机制,为进一步研究此类药物的线粒体毒性提供指导。方法我们采用Hepa RG细胞为体外模型,系统地研究比较三种药物在导致细胞氧化损伤方面的作用特点,包括采用ABTS法检测药物对细胞总抗氧化能力的影响,采用WST法检测超氧物歧化酶活性变化,以及检测过氧化氢酶以及谷胱甘肽过氧化物酶活性的变化。用western-blot检测氧化应激相关蛋白去乙酰化蛋白SIRT1,SIRT3表达的变化,探讨三种药物氧化损伤的作用机制。结果Hepa RG细胞经过药物处理48小时后,细胞的总抗氧化能力发生了下降,曲格列酮的效果最为明显。25μM曲格列酮组总抗氧化能力下降至对照组的(87.36±0.06)%,50μM曲格列酮组总抗氧化能力下降至对照组的(57.66±0.05)%,p<0.05,差异具有统计学意义。50μM罗格列酮组总抗氧化能力下降至对照组的(85.48±0.056)%,50μM吡格列酮组总抗氧化能力下降至对照组的(80.00±0.08)%,p<0.05,差异具有统计学意义。三种噻唑烷二酮类药物对超氧化歧化酶和过氧化氢酶的活性抑制效果较为明显,对谷胱甘肽过氧化物酶的活性影响较小。50μM曲格列酮处理Hepa RG细胞48小时后,细胞内超氧化歧化酶的活性降至对照组的50%左右,罗格列酮和吡格列酮在50μM组处理下,超氧物歧化酶和过氧化氢酶的活性发生了下降,而谷胱甘肽过氧化物酶的活性与对照组相比差异无统计学意义。MDA含量发生了明显的改变,与对照组(4.812±1.980)nmol/mg prot,相比,25μM曲格列酮组MDA含量升高至(8.776±1.254)nmol/mg prot,50μM曲格列酮组MDA含量升高至(16.841±2.860)nmol/mg prot,p<0.05差异有统计学意义。50μM罗格列酮组MDA含量升高至(8.678±2.340)nmol/mg prot,50μM曲格列酮组MDA含量升高至(6.727±3.104)nmol/mg prot,p<0.05差异有统计学意义。曲格列酮能明显地下调去乙酰化蛋白SIRT1,SIRT3的表达,具有明显的浓度依赖效应,50μM组最为明显。罗格列酮组SIRT1和SIRT3的表达在中、高浓度组发生了下降。吡格列酮组的两种蛋白与对照组相比,未发生明显的变化。小结三种噻唑烷二酮类药物均可引起不同程度的氧化应激,其中曲格列酮效果最明显,罗格列酮次之;三种药物引起氧化应激主要原因是活性氧的生成增多,超出细胞抗氧化能力范围,对部分抗氧化酶活性有抑制作用;药物引发氧化应激的途径可能与降低脱乙酰蛋白SIRT1,SIRT3的表达有关。4.基于ITRAQ的噻唑烷二酮类药物线粒体毒性差异蛋白研究目的筛选噻唑烷二酮类药物曲格列酮、罗格列酮和吡格列酮处理Hepa RG细胞48小时后,不同浓度的药物处理与对照组的差异蛋白,并鉴定蛋白,通过生物信息学分析,结合其余毒性指标,探讨其有害结局路径及分子起始事件,阐明毒性作用机制。方法我们采用三种噻唑烷二酮类药物曲格列酮、罗格列酮和吡格列酮为研究对象,Hepa RG细胞为体外模型,以不同浓度药物处理细胞后,提取细胞总蛋白,使用i TRAQ试剂进行标记,经过酶解肽段离线预分离及LC-MS/MS质谱分析,并对结果进行DAVID生物信息学分析,探讨三种药物的作用机制,为临床前期噻唑烷二酮类药物肝毒性的早期发现提供支持。结果在曲格列酮组i TRAQ的筛选结果中,共检出3474个蛋白,其中,与对照组相比,p值小于0.05,且差异倍数均大于1.3倍或小于0.77倍的蛋白在高浓度组有358个,在中浓度组有299个,在低浓度组有216个。在罗格列酮组共检出4715个蛋白,其中,与对照组相比,p值均小于0.05,且差异倍数大于1.2倍或小于0.77倍的蛋白在高浓度组有134个,在中浓度组有119个,在低浓度组蛋白有175个。吡格列酮组共检出6477个蛋白,其中,与对照组相比,p值均小于0.05,且差异倍数大于1.3倍或小于0.77倍的蛋白在高浓度组有61个;在中浓度组有52个;在低浓度有77个。我们的结果显示,综合不同浓度组曲格列酮处理后差异表达蛋白的富集程度排序,发现蛋白定位转运、氧化磷酸化、线粒体呼吸酶链复合解耦联、核酸合成等有关的生物学过程富集度较高,而这些蛋白在细胞内的定位富集最高区域为线粒体以及细胞膜结构等,其分子功能主要包含酶、核酸装定,NADH泛醌化等,其差异均具有统计学意义。罗格列酮处理后差异表达蛋白主要富集在氨基酸代谢合成、呼吸过程等有关的生物学过程,这些蛋白在细胞内的定位富集最高区域为高尔基体、线粒体膜等,其分子功能主要包含铁离子结合、金属螯合等;吡格列酮处理后差异表达蛋白的富集程度排序,发现激素代谢、线粒体形态、缺氧反应等有关的生物学过程富集度较高,,而这些蛋白在细胞内的定位富集最高区域为内质网、细胞膜结构、细胞表面,其分子功能主要包含肝素结合、碳氧结合等,其差异均具有统计学意义。同时,我们进一步筛选出了三种药物作用的特异蛋白,对这些蛋白加以研究有可能阐明药物线粒体毒性机制。小结三种药物作用机制各有特点,但三种药物对细胞的呼吸功能,线粒体,氧化磷酸化均有明显的影响,这有可能是三者肝毒性差异的重要原因之一。结论本研究以线粒体毒性为切入点,系统地研究和比较了三种药物的毒性特点,曲格列酮对线粒体的毒性作用,可能是阐明其肝毒性有别于罗格列酮和吡格列酮的关键问题,同时,以线粒体毒性为指标开展临床前期药物安全性评价有一定的研究价值。