前言:2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus，T2DM)是由环境、基因及内分泌因素引起的一种病理状态。2006年世界卫生组织(world health organization，WHO)调查结果显示，从1996年至2006年10年内，T2DM患者数量由3000万迅速增至1.7亿，预计到2030年将达3.66亿。T2DM数量以惊人的速度增长，已经成为世界范围内的公共健康问题。除了人口老龄化，近年来世界上许多地区肥胖人口数量的急剧增加，是导致T2DM以惊人速度增长的重要原因。中华医学会糖尿病分会最新调查显示：由于中国经济改善以及国人生活习惯的改变，T2DM发病率明显上升，已成为威胁国人健康的第一大疾病。T2DM患者长期处于高血糖状态，可引起多系统损害，如冠心病、缺血性或出血性脑血管疾病、肾动脉硬化、肢体动脉硬化闭塞症，引起功能缺陷及衰竭。病情严重或应激时可发生急性代谢紊乱，降低了生活质量，健康和生命安全受到严重威胁。多年来对于T2DM的临床治疗一直采用传统的保守治疗，包括药物刺激胰岛细胞分泌及胰岛素替代疗法。然而，美国一项研究表明：药物治疗和胰岛素替代疗法不能延缓T2DM患者并发症的出现及改善预后。近些年来，移植外科一直致力于通过胰腺移植解决T2DM患者胰岛细胞功能衰竭的问题。这一方法疗效与胰岛素替代疗法类似，都存在胰岛素抵抗逐渐加重和胰岛素分泌相对不足的问题。而且，移植的各种并发症常使胰岛细胞的功能受到影响，因而实际效果不佳。因此，探求T2DM的有效治疗方案是亟待解决的科学问题。　　 近些年来，减肥外科医生进行减肥手术时偶然发现：接受胃旁路(Roux-en-Ygastric bypass，RYGB)手术的合并T2DM的肥胖病人，术后血糖降至正常，并能长期维持。美国减肥外科医生Walter Pories于1980年首次发现并报道了这一现象。目前，临床上大量报道都支持RYGB手术对T2DM的治疗作用。因为在术后体重明显下降之前，数天内血糖即降至正常范围，提示血糖的控制是胃旁路手术本身的作用，而非肥胖相关代谢异常缓解的结果。同期研究还发现：由于RYGB手术改变正常消化道结构，术后一些胃肠激素分泌发生变化，进而推测T2DM的缓解可能与手术后胃肠激素的变化有关。其中，胰高血糖素样肽1(glucagon-likepeptide-1，GLP-1)可能是重要的调节因子之一。GLP-1主要由末段回肠内分泌L细胞受食物刺激后分泌，分泌后有选择地作用于组织，调节血糖稳态。然而，GLP-1的确切作用机制尚未完全清楚。本研究采用先天性T2DM大鼠Goto-Kakizaki(GK)和大鼠胰岛β细胞系RIN-m5F，通过手术建立GK大鼠RYGB手术模型，探讨RYGB手术后GLP-1的变化及其对糖尿病控制和抗胰岛β细胞凋亡的作用机制，进而明确RYGB治疗T2DM的机理，为外科手术治疗T2DM提供理论依据。　　 材料与方法:　　 一、实验材料与仪器　　 8周龄SPF级雄性GK大鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。周龄、性别匹配的Wistar大鼠购自中国医科大学附属盛京医院实验动物中心。大鼠胰岛β细胞系RIN-m5F购自美国国立细胞库(American Type Culture Collection，ATCC)。10％水合氯醛；RPMI1640培养基；exendin-4；抑肽酶；胰蛋白酶；二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidylpeptidase-4，DPP-4)；乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraaceticacid，EDTA)；大鼠GLP-1R、Ki-67、bcl-2、bax、caspase-3抗体；聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride，PVDF)；大鼠胰岛素酶联免疫吸附分析(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)试剂盒；大鼠GLP-1 ELISA试剂盒等。　　 显微手术器械，细胞培养工作台，SANYO MDF-U-80℃冰箱，OLYMPUSAX70倒置显微镜，GFL THERMOLAB振荡水浴箱，高速冷冻离心机，电泳仪，半干转印仪，电子天平，微量泵，PH计，血糖仪及血糖试纸等。　　 二、实验方法　　 (一)实验分组及处理GK大鼠30只，Wistar大鼠10只分为以下四组：　　 1、RYGB组：GK大鼠10只。贲门处横断，远断端结扎闭锁。距Treitz韧带10 cm横断空肠，远端肠袢经结肠前上提与食管断端吻合，近端肠袢在食管空肠吻合口远侧10 cm处与远端肠袢行空肠间侧侧吻合。旷置胃、十二指肠和上段10cm空肠。　　 2、假手术(sham operation，SO)组：GK大鼠10只。在贲门处切断后再吻合，距Treitz韧带10 cm处切断空肠后原位端端吻合，未改变胃肠道正常解剖结构。　　 3、节食组：GK大鼠10只。按每日正常食量的1/3喂养。　　 4、对照组：Wistar大鼠10只，作为非糖尿病正常对照。　　 在第一部分，检测手术前后大鼠体重、摄食率、空腹血糖(fasting blood sugar，FBS)、口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test，OGTT)、血浆胰岛素以及胰岛素抵抗的变化，探讨RYGB手术对2型糖尿病GK大鼠葡萄糖代谢的影响。　　 在第二部分，检测手术前后大鼠血浆GLP-1的变化以及胰腺组织GLP-1受体表达的变化，探讨RYGB手术改善2型糖尿病GK大鼠葡萄糖代谢的可能机制。　　 在第三部分，通过体外实验，检测GLP-1受激动剂exendin-4对大鼠胰岛β细胞RIN-m5F胰岛素分泌的影响，并通过检测Ki-67、bcl-2、bax、caspase-3等蛋白表达，探讨exendin-4对RIN-m5F凋亡调控的影响及机制。　　 (二)检测方法　　 1、电子称测量体重及摄食量，计算摄食率。摄食率=24小时摄食量(g)/体重(Kg)。　　 2、血糖仪法检测空腹血糖(FBS)和口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。　　 3、酶联免疫吸附分析(ELISA)法检测血浆胰岛素和GLP-1水平。　　 4、免疫蛋白印迹杂交(Western blot)检测胰腺组织GLP-1受体蛋白表达，RIN-m5F细胞GLP-1受体以及Ki-67、bcl-2、bax和caspase-3蛋白的表达。　　 (三)统计学处理实验数据采用均数±标准差(x±s)表示，用SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析，P<0.05差异具有显著性。　　 结果:　　 一、RYGB手术对GK大鼠血糖控制和胰岛素分泌的影响术后RYGB组、假手术组和节食组体重及摄食率均下降。术后第4周，以节食组体重和摄食率下降最为显著。RYGB组与假手术组和节食组相比较，手术后FBS水平明显著降低(P<0.01)，术后第2～4周，RYGB组与对照组比较，FBS水平无显著差异。与假手术组和节食组比较，RYGB组术后基础血浆胰岛素水平显著降低(P<0.05)，葡萄糖灌胃后30 min血浆胰岛素水平明显升高(P<0.05)。术后第3周时，RYGB组与假手术组和节食组相比，OGTT显著改善，胰岛素抵抗指数HOMA-IR(Homeostasis Model Assessment-Insulin Resistance)值明显下降；RYGB组与对照组相比，基础及葡萄糖灌胃后血浆胰岛素水平无显著差异。　　 二、RYGB手术对GK大鼠血浆GLP-1水平及胰腺组织中GLP-1受体表达的影响手术前RYGB组、假手术组和节食组血浆GLP-1水平均显著低于对照组(P<0.05)。手术后RYGB组血浆GLP-1水平逐渐升高，与假手术组和节食组相比较，差异有统计学意义(P<0.05)。RYGB组血浆GLP-1水平在术后第3周时与对照组相比较无显著差异，在术后第4周时显著高于对照组(P<0.05)。假手术组和节食组血浆GLP-1水平术后仍在较低水平波动，显著低于对照组(P<0.05)。RYGB组GLP-1R蛋白表达活性显著上调，显著高于假手术组和节食组GLP-1R蛋白表达水平(P均<0.05)。而假手术组和节食组GLP-1R表达水平则显著低于对照组(P均<0.05)。　　 三、Exendin-4对大鼠胰岛β细胞RIN-m5F功能及凋亡的影响高糖组RIN-m5F细胞中GLP-1R蛋白表达活性降低，与对照组相比较，差异有显著性(P<0.05)。GLP-1R激动剂exendixi-4能促进RIN-m5F细胞分泌胰岛素，且随着exendin-4浓度的增加，胰岛素的分泌量呈上升趋势。exendin-4组Ki-67蛋白表达活性为68.8±11.1，对照组Ki-67表达活性为24.5±6.6，二者相比较，差异有显著性(P<0.05)。在exendin-4组与对照组中，bcl-2蛋白表达活性分别为146.4±19.8和99.2±22.3，bax蛋白表达活性分别为45.0±15.9和113.1±23.9，bcl-2/bax比值分别为3.2±0.4和0.8±0.2，caspase-3蛋白表达活性分别为35.9±9.6和86.1±5.9。exendin-4组bcl-2表达显著高于对照组，bax和caspase-3表达显著低于对照组，bcl-2/bax显著高于对照组。　　 结论:　　 1、RYGB手术对GK大鼠的2型糖尿病具有明显的治疗作用。　　 2、GK大鼠2型糖尿病缓解与术后食物摄入减少及体重变化无明显关系。　　 3、胃旁路手术增加GK大鼠血浆GLP-1水平。　　 4、胃旁路手术后GK大鼠胰腺组织GLP-1受体表达水平明显上调。　　 5、GLP-1通过受体对胰岛β细胞调控，可能是术后2型糖尿病缓解的重要原因。　　 6、高糖可降低RIN-m5F细胞GLP-1受体蛋白的表达水平。　　 7、Exendin-4促进RIN-m5F细胞胰岛素分泌功能，并对细胞具有明显的保护作用。