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合江棘蛙(Paa robertingeri)(Anura:Ranidae)为蛙科棘蛙属物种,仅分布于云贵高原的四川、云南和重庆等少数地区,属中国特有种,其数量稀少,保护级别为濒危。Cathelicidin抗菌肽是一种特殊的抗菌肽大家族,由保守的N-端信号肽区域,高度保守的“cathelin”间隔肽区域和高度特异的C-末端成熟肽区域组成,经酶切作用释放出成熟肽。成熟肽在大多数脊椎动物的先天性免疫系统中发挥着重要作用,作为抵抗病原菌入侵和抵御其他外界伤害的第一道防线。目前几乎在所有脊椎动物,包括人、哺乳类、鸟类、爬行类和鱼类中均有发现,但在两栖类中关于cathelicidin的报道极少,仅在棕点湍蛙(Amolops loloensis)、脆皮大头蛙(Limnonectes fragilis)、双团棘胸蛙(Paa yunnanensis)、牛蛙(Rana catesbeiana)和红瘰疣螈(Tylototriton verrucosus)体内有报道cathelicidins抗菌肽。在本论文中,对合江棘蛙cathelicidins抗菌肽进行了结构、功能等初步研究。从合江棘蛙皮肤组织提取总RNA,构建了皮肤c DNA文库,根据cathelicidin家族基因序列特征设计引物,使用半巢氏PCR的方法,克隆到了两条编码cathelicidins前体的c DNA序列,经过分析比对,推断出两条成熟肽序列:cathelicidin-PR1和cathelicidin-PR2,分别由29个(RKCNLFCKAKQKLKSLSSVIGTVVHPPRG)和25个(KECKDYLCKLLMKLGSSSHIESIDP)氨基酸残基组成。进化分析发现,合江棘蛙cathelicidins与双团棘胸蛙cathelicidin有很高的同源性,两者在进化过程中亲缘关系最近,与物种分类吻合。合江棘蛙与其他两栖类蛙科动物cathelicidins独立成一簇,与哺乳类、爬行类、鸟类、鱼类来源的cathelicidins相互独立,与物种进化顺序略有不同,为cathelicidins基因家族起源和进化提供了证据。Cathelicidin-PR1和cathelicidin-PR2分子量均非常小,分别为3195.88Da和2838.34Da,两者各有一条二硫键,圆二色谱检测显示两者在无菌水溶液中均为无规则卷曲结构的二级结构,而在拟膜环境的SDS溶液(60m M)中主要呈α-螺旋结构,与理论预测结构相近,这种结构对发挥杀菌作用发挥着重要作用。在供试的13株细菌和真菌中(含标准菌株和临床分离的耐药菌株),化学合成的cathelicidin-PR1对大部分菌株均出现杀菌作用,对6种菌(含细菌和真菌)显示较强抗性,特别是对临床分离的耐药菌株,其最小抑菌浓度(MIC)可达到11.73μM;而cathelicidin-PR2则未检测到任何抗菌活性。杀菌动力学显示,在5倍MIC浓度时,cathelicidin-PR1可在45 min内杀死临床分离蜡样芽孢杆菌,较氨苄西林快(需1.5 h以上)。两者的溶血活性都极低,在浓度100μg/ml时,cathelicidin-PR1与cathelicidin-PR2溶血率分别为3.87%、1.12%;将浓度提高到200μg/ml时,溶血率分别为1.78%和2.01%,充分说明两者无溶血活性。红细胞凝集实验结果显示在无Ca2+存在时,cathelicidin-PR1无凝集活性,cathelicidin-PR2有弱凝集活性;在有Ca2+存在时,两者均无凝集活性。cathelicidin-PR1和cathelicidin-PR2在80μg/ml浓度对DPPH自由基清除率均极低,分别为2.92%和2.30%。以上活性说明cathelicidin-PR1有望成为一种多肽类抗菌药物先导化合物,通过设计修饰开发出新型药物。