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弧菌病是影响贝类养殖产业发展的重要因素。近年来的研究表明,环境生态系的波动状况可反映贝类养殖环境及自身健康状态,因此明确水生环境的动态变化规律,可及时调控相关的关键因素,从而达到对疾病预警和防控的目的。本论文在对鲍Haliotis养殖过程中主要水质因子、养殖环境及鲍消化道中细菌和弧菌的数量、细菌种群结构及其多样性的动态变化特点三大主要因素的监测研究基础上,采用高通量测序技术、荧光染色计数、传统选择性培养基方法、PCR快速检测等技术手段进行深入分析,推算特定因子作用下宿主发病死亡的概率方程式,以及各相关因素之间的联系,同时掌握鲍养殖过程中最常见的重要弧菌病原的生物学特点和防治方法。通过以上研究分析,最终阐明鲍养殖周期内各相关因素的动态变化规律,从而探讨弧菌病的发生规律,并进一步对鲍的弧菌病进行预警防控。本论文的实施可为贝类的细菌性病害预防控制提供新的思路,具有重要的科学意义和应用价值,本研究具体探讨以下问题: (1)由正常状态到疾病发生前后各因素如何发生变化? (2)疾病发生时,关键因子如何发挥主导作用以及对疾病有怎样的预示? (3)当相关因素发生变化时,发病的概率数如何变化? 由于弧菌往往以条件致病菌的角色存在,环境因子及其自身的数量是弧菌病发生过程的重要因素。因此,本文首先解析了与鲍养殖过程密切相关的14个环境因子相互之间的关联,包括养殖水体的水温、盐度等14种水质因子,以及细菌数量、细菌多样性指数。本论文以广东、福建沿海多个鲍养殖场为主要监测区域,定时定点采样,完成约2周年的实地采样、检测和分析,研究不同时期鲍养殖环境中及其体内的细菌总数、弧菌数量及比例、细菌种群结构(优势细菌种类及比例)、细菌多样性和丰度等指数的动态变化,同时揭示水质因子的季节变化规律。整个监测周期内,不同采样点鲍的发病次数共计3次,通过分析发病前后数据的变化,利用多元逐步回归分析、多因子分析、主成分分析等统计手段探讨与疾病发生密切关联的关键因子及其作用效果,最后得到关键因子与鲍死亡率的关系方程式,初步推测在特定因子作用下,鲍发病死亡的概率,从而为贝类弧菌病的预警提供重要参考依据。 本次长期监测结果显示,几乎每年夏季,各地区均出现不同程度的鲍死亡现象,通过检测分析,结果显示每次鲍异常死亡前后,弧菌占可培养细菌的比例高,是绝对的优势种群,其中以哈维弧菌Vibrio harveyi最为常见。长期监测表明,养殖水体中的弧菌数量的季节性变化明显,低温季节养殖水体中弧菌数量级仅为101 CFU·mL-1,高温季节养殖水体的弧菌数量级最高达104.8 CFU·mL-1。荧光染色计数结果表明室内工厂化养殖水体和海区水体的细菌总数季节性变化不显著,数量级均在108~9 CFU·mL-1,但不同地区尤其是外海区的细菌总数存在很大的地域差异,而皱纹盘鲍H.discus hanai和杂色鲍H.diversicolor不同养殖品种间体内弧菌数量差异不显著。 同步地,对65个以上的样品进行高通量测序,获得247125条以上有效序列(>7418 OTUs),数据分析结果显示不同样品之间多样性存在一定的差异,细菌种类多样性丰富的时间集中在6~10月份。而鲍养殖水中的细菌多样性明显比鲍消化道中的细菌多样性更为丰富。菌种方面,养殖水体中比例较高的菌属多数为不可培养细菌。而在养殖动物疾病发生过程中扮演重要角色的弧菌种群虽然常年存在,但大多数月份中,弧菌在整个细菌种群中所占比例较低,而在高温季节如5、7、9月,弧菌群比例则明显增大。发现了另一个不容忽视的支原体类群在养殖水中几乎常年存在,且在多数月份成为绝对优势的种群,其在病鲍体内的比例也非常高(个别月份达80%以上)。 对各地区鲍养殖场的环境因子、细菌多样性及鲍的死亡率综合分析结果显示ORP、水温、盐度、pH值、硝酸盐是最关键的因子,其中水温、盐度、pH值主要影响水体的细菌多样性,ORP、DO、氨氮主要影响贝体内的细菌多样性。面外海区整体环境比较稳定,因此外海区的水体和鲍体内细菌多样性受以上环境因子的影响较小。结合各月死亡率进行统计分析,结果显示pH值是与宿主死亡率密切相关的最关键因子,二者之间呈现显著性负相关的关系(P<0.05),预测发病死亡概率的关系方程式如下:死亡率=0.6371-0.07606×pH值。 在监测过程确诊了鲍的最典型弧菌病“脓疱症”的病原——哈维弧菌,并全面了解病原菌株的生物学特性和生长条件等。该菌种也是近年来贝类养殖中出现频率最高的病原之一。人工感染试验显示该菌株具强毒性,仅通过浸泡方式感染7~10天即可使不同发育阶段的稚鲍足部出现脓疱症状(半致死浓度为7.76×105CFU·mL-1)。菌株对复方新诺明、氟苯尼考、链霉素、强力霉素等药物高度敏感,对卡那霉素和克林霉素不敏感。 本论文对监测获得的546个弧菌株进行了耐药性追踪研究。结果显示鲍消化道中弧菌对各种药物的耐药率明显低于养殖水体中弧菌的耐药率。值得注意的是,养殖水体和鲍消化道中的弧菌对多种药物的耐药率分别在高温季节出现重叠高峰。结果还显示养殖水体中弧菌的多重耐药率普遍较高。可见,水生弧菌的耐药状况不容忽视,而水生弧菌对多种药物的耐药状况存在一定的季节规律。另外,论文结果也显示部分药物与环境因子如温度、盐度、pH值的密切相关。 综上所述,本论文对弧菌病的发生规律总结如下:高温季节是弧菌病流行的高发时期,尤其是当水温超过29℃时鲍处于易感状态,而且当养殖环境中弧菌数量在短时间内发生突变时(达到106~7CFU·mL-1),同时结合关键理化因子的变化如pH值明显下降时,此时有极大的可能发生弧菌病。在对疾病的防控方面可参考相关因子的方程式,特别关注最关键的理化因子pH值的变化,还是以调控养殖水质环境为主,疾病高发季节可考虑投放有益微生物预防弧菌病的发生。论文中的部分结果将为今后针对海水贝类的病害预警研究提供重要的数据基础和应用参考依据。