论文部分内容阅读
芥蓝（Brassica oleracea var.alboglabra）是十字花科芸薹属蔬菜,以肥嫩的花薹及嫩叶为主要食用器官。由于其含有丰富的维生素C、类胡萝卜素、芥子油苷和多酚等多种营养物质,而深受消费者的喜爱和欢迎。八氢番茄红素脱氢酶（Phytoene desaturase,PDS）是类胡萝卜素生物合成途径中的关键限速酶之一。试验前期我们发现在芥蓝中PDS基因有两个成员,但两个成员各自的功能及相互关系尚不清楚。因此,本研究以白花芥蓝为试验材料,通过时空表达、启动子顺式元件分析结果选择光和激素处理芥蓝幼苗、亚细胞定位、CRISPR敲除突变体表型,对BaPDSs基因家族两个成员的功能差异进行了系统分析,研究结果为提高芥蓝中类胡萝卜素含量和改善芥蓝营养品质提供理论依据。本研究主要结果如下:1、通过同源序列检索分析设计特异性引物,采用反转录PCR方法成功分离出芥蓝PDS基因家族的两个成员,并命名为BaPDS1和BaPDS2,NCBI登录号分别为KX426039和KX426040。这两个基因的CDS区长度及其编码的氨基酸数分别为1692bp、563个和1698 bp、565个。根据同源性分析和构建的进化树,表明BaPDSs蛋白与十字花科的甘蓝、亚麻芥、白菜、拟南芥等植物的亲缘关系较近,同时发现在进化过程中PDS蛋白较保守。2、对芥蓝进行时空表达分析,发现BaPDS1和BaPDS2基因表达水平在芥蓝不同发育时期和组织器官间均存在显著差异。萌动种子期BaPDSs表达量较低,之后迅速上升;BaPDS1在成熟期器官间呈现组成型表达,BaPDS2在器官间表达差异较大,幼果中未检出;花器官中萼片的BaPDSs表达量显著低于其他组织,在开花过程中,雄蕊和雌蕊的BaPDS1表达水平出现上调。3、分离获得BaPDS1和BaPDS2启动子序列,分别进行顺式作用元件分析,统计两者相同和差异的顺式元件,并根据预测结果选择光和激素对芥蓝幼苗进行三种不同处理。结果表明,不同光质处理下,BaPDS1对蓝光和红蓝光有响应,蓝光促进BaPDS1表达,3 h为峰值,后期表达量下降,红蓝光照射下BaPDS1表达量明显高于对照,BaPDS2只对蓝光有响应,但蓝光抑制其表达。不同光强处理下,强光可诱导BaPDS1的表达量增加,且在24 h出现峰值,弱光诱导BaPDS2的表达量增加,在12 h时出现峰值,黑暗抑制了BaPDS2表达,且表达量随时间变化逐渐趋向于0。不同激素处理下,BaPDS1和BaPDS2共同响应SA、ABA和MeJA,此外,BaPDS2还响应GA3。在ABA处理下,BaPDS1和BaPDS2表达量都呈先下降后上升趋势,且后期表达量明显高于对照;SA处理下,BaPDS1和BaPDS2表达量都显著低于对照;GA3处理下,BaPDS1表达量与对照无明显差异,而BaPDS2表达量在1 h时出现峰值,1 h后表达量基本上都低于对照;MeJA处理下,BaPDS1表达量基本低于对照,而BaPDS2表达量明显高于对照,除12 h外。4、构建亚细胞定位载体pC2300-35S-BaPDS1-eGPF和pC2300-35S-BaPDS2-eGPF,并将其分别转至芥蓝原生质体中。经荧光显微镜观察发现,BaPDS1和BaPDS2均定位于叶绿体上,与预测结果一致。5、选择BaPDS1和BaPDS2基因的共同靶位点,构建CRISPR/Cas9载体（pCC-Target-sgRNA）,转入农杆菌浸染芥蓝带柄子叶,获得纯合型转基因双突变和单突变植株,通过对植株表型的观察及色差测定发现,无论单突还是双突突变体,植株均表现出白化表型,但BaPDS1和BaPDS2双突变的植株白化现象更为明显,表明BaPDS1、BaPDS2两个基因对芥蓝的生长发育是同等重要的,缺少任何一个都会阻碍类胡萝卜素和叶绿素的正常合成,导致植物的生长发育受阻,最终致使植株白化致死。结果表明BaPDS1和BaPDS2基因在芥蓝类胡萝卜素合成中分别发挥不同的作用,但两者功能还存在部分互补的关系。