研究背景肝纤维化和肝硬化是全世界范围内存在的危及公众健康的难题,是多种慢性肝病发生发展的共同病理过程,目前仍缺乏十分有效的防治手段。肝硬化引起的肝内血管阻力增加是门静脉高压产生的重要因素。研究表明肝窦内皮细胞（LSEC）和肝星状细胞（HSC）在增加肝内血管阻力方面起了关键作用。近年来,门静脉高压症的分子机制的研究不断取得进展,特别是HSC激活和收缩机制成为研究热点。活化的HSC增殖、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达增加并大量分泌细胞外基质（ECM）,导致肝纤维化和肝内结构的重建。并且,活化的HSC具有收缩性,能够使肝窦直径缩小,窦内阻力增加,最终引起肝硬化和门静脉高压。肾素-血管紧张素系统（RAS）在调节血压和维持电解质平衡中起着至关重要的作用。抑制全身性RAS可以有效降低门脉高压。除全身性RAS外,研究表明局部RAS存在于包括肝脏在内的多个器官中。肝内RAS在慢性肝病中激活,局部血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）水平升高,可诱导一系列纤维化作用的产生。激活的HSC可以表达血管紧张素Ⅱ 1型受体（AT1R）,而AT1R在HSC激活和纤维形成中起重要作用。AT1R与细胞收缩和ECM产生相关的几个信号通路的激活有关。其中,RhoA/Rho激酶通路是参与肝纤维化和门脉高压发展的重要通路之一。肝窦在维持肝脏微循环和调节门静脉血流中起着重要作用,肝窦阻塞及由此导致的肝血管阻力增加是门静脉高压症产生的主要原因。在肝纤维化和肝硬化中,肝窦毛细血管化导致新的毛细血管网络的形成,从而导致肝脏微循环功能的改变。研究表明肝窦内皮细胞毛细血管化促进HSC活化和纤维化,LSEC和HSC之间的相互作用促进胶原沉积、纤维形成和血管生成。此外,肝窦重构和肝内血管生成增加肝窦阻力,促进了肝纤维化和门脉高压的发生发展。卡维地洛（Carvedilol）是一种非选择性β受体阻滞剂（NSBB）,可有效降低门静脉压力,临床上常用于预防食管静脉曲张出血。目前研究报道卡维地洛还具有减轻肝脏炎症反应、抗血管生成、缓解肝损伤等作用。除了直接减少门脉血流外,卡维地洛可能还通过降低肝内阻力而缓解门静脉高压,但目前还缺少分子机制的相关研究。本课题研究卡维地洛对Ang Ⅱ诱导的HSC增殖和收缩的影响,探讨卡维地洛对四氯化碳（CCl4）诱导的肝硬化小鼠模型肝窦毛细血管化的作用,并阐明了其缓解肝纤维化和门静脉高压的潜在分子机制。第一部分卡维地洛对血管紧张素Ⅱ诱导的肝星状细胞增殖和收缩的影响及机制研究（一）目的探讨卡维地洛在Ang Ⅱ诱导的HSC增殖和收缩中的作用及其可能的分子机制。（二）方法1.细胞培养我们用人肝星状细胞株LX-2进行体外研究。LX-2细胞在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养、传代。2.细胞增殖测定HSC接种于96孔板培养,用不同浓度的Ang Ⅱ和卡维地洛处理24小时后,加入CCK-8测定不同浓度的药物对LX-2细胞增殖的作用。3.细胞周期测定细胞接种于6孔板中培养,加入Ang Ⅱ和各浓度梯度的卡维地洛处理24小时。经过收集细胞、固定等处理后,用Muse细胞分析仪对各组细胞周期进行测定和分析。4.流式细胞仪分析细胞凋亡HSC接种于6孔板后,用Ang Ⅱ和不同浓度的卡维地洛处理24小时。根据PE Annexin V凋亡检测试剂盒说明书处理细胞后,用流式细胞仪分析各组细胞凋亡率。5.荧光染色检测细胞凋亡HSC接种于6孔板后,用Ang Ⅱ和指定浓度的卡维地洛处理24小时。用Hoechst 33258荧光染色剂染色,在荧光显微镜下观察凋亡的HSC并拍照。6.凝胶收缩试验在24孔板中制备水合胶原凝胶,HSC接种于每孔凝胶上培养24小时。在各孔分别加入Ang Ⅱ和不同浓度的卡维地洛或ROCK抑制剂（Y-27632）,24小时内观察并测定各孔凝胶的直径变化。7.肝纤维化小鼠模型的构建及验证C57BL/6小鼠被分为四组:正常对照（Control）组、橄榄油（Oil）组、CCl4组、CCl4+卡维地洛（10mg/kg/d,灌胃）组。通过腹腔注射CCl4共6周构建肝纤维化小鼠模型。小鼠麻醉后取肝组织经固定、石蜡包埋、切片后进行H＆E和天狼星红染色,封片后在光学显微镜下观察并拍照。8.免疫组织化学染色小鼠肝组织石蜡切片经过脱蜡、连续脱水、抗原修复等处理后,加内源性过氧化物酶抑制剂,37℃孵育30分钟。组织切片经过一抗、二抗孵育,用二氨基联苯胺（DAB）染色,细胞核用苏木素复染,封片后在光镜下拍照。9.Western blot检测细胞周期和凋亡相关蛋白、纤维化相关蛋白、信号通路相关蛋白的表达变化在体外实验中,HSC接种于6孔板中,加入Ang Ⅱ和不同浓度的卡维地洛处理后提取蛋白并测定蛋白浓度。用Western blot检测各组HSC的细胞周期相关蛋白（Cyclin D、Cyclin E、CDK2 和 CDK4）、凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax）、纤维化相关蛋白（Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ）和信号通路蛋白（AT1R、RhoA和ROCK2）的表达。10.实时荧光定量PCR检测细胞信号通路成分在mRNA水平的表达变化HSC接种于6孔板中,加入Ang Ⅱ和不同浓度的卡维地洛处理后提取总RNA,逆转录后用实时荧光定量PCR测定各组细胞的RhoA、ROCK2在mRNA水平的表达变化。11.Western blot测定小鼠肝组织中的纤维化相关蛋白、信号通路相关蛋白的表达提取各组小鼠肝组织的蛋白并测定蛋白浓度,用Western blot检测各组肝组织纤维化相关蛋白（α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ）、信号通路蛋白（AT1R、RhoA和ROCK2）、血管紧张素转换酶（ACE1）的表达水平。（三）结果1.卡维地洛对Ang Ⅱ处理的HSC的细胞增殖有抑制作用。CCK-8结果表明,Ang Ⅱ剂量依赖性地增强了 HSC的增殖能力,当Ang Ⅱ浓度为1μM时,对细胞的增殖有显著的影响。卡维地洛能够剂量依赖性地抑制Ang Ⅱ诱导的HSC增殖。2.卡维地洛影响HSC细胞周期进程,延长G0/G1期。Muse细胞分析仪测定细胞周期的结果表明,卡维地洛可以延长HSC的G0/G1期,降低Ang Ⅱ处理的HSC的S期和M期的细胞数量。并且,Western blot结果显示卡维地洛可以通过抑制Cyclin D、Cyclin E、CDK2和CDK4的蛋白表达而导致细胞周期阻滞,从而抑制HSC增殖。3.卡维地洛增加Ang Ⅱ处理的HSC的凋亡。流式细胞仪分析结果示卡维地洛剂量依赖性增加了早期凋亡HSC的比例。Hoechst染色后在荧光显微镜下观察,经卡维地洛处理后的细胞出现核碎裂和DNA凝聚,并呈显著的亮蓝色染色。另外,Western blot结果分析发现Ang Ⅱ组HSC的Bcl-2/Bax值增加,而卡维地洛能够剂量依赖性下调两者的比值。4.卡维地洛抑制Ang Ⅱ处理的HSC的收缩。胶原凝胶收缩实验结果示Ang Ⅱ处理后细胞发生收缩,使凝胶直径较阴性对照组减小,而卡维地洛抑制Ang Ⅱ诱导的HSC收缩。5.卡维地洛影响AT1R介导的RhoA/ROCK2通路组分的表达。实时荧光定量PCR和Western blot分析结果表明卡维地洛处理后HSC中AT1R介导的RhoA/ROCK2通路组分的mRNA和蛋白表达均降低。6.卡维地洛减轻肝纤维化模型小鼠肝组织胶原沉积。H＆E和天狼星红染色结果显示卡维地洛处理组小鼠肝组织胶原沉积较CC14模型组明显减轻。免疫组化染色分析示,与CCl4模型组相比,卡维地洛处理组小鼠肝脏的纤连蛋白（Fibronectin）表达减少。另外,Western blot结果示卡维地洛处理组的小鼠肝组织α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的蛋白表达较CCl4模型组减少。7.卡维地洛处理后肝纤维化模型小鼠肝组织的ACE1表达减少。免疫组织化学染色和Western blot结果示ACE1在CCl4诱导的肝纤维化小鼠肝组织中高表达,而卡维地洛处理组小鼠肝组织ACE1的蛋白表达明显降低。（四）结论1.体外实验表明卡维地洛能够通过阻碍细胞周期进程而抑制Ang Ⅱ诱导的HSC增殖。2.体外实验表明卡维地洛能够促进Ang Ⅱ处理的HSC的凋亡。3.卡维地洛通过干扰AT1R介导的RhoA/ROCK2通路抑制Ang Ⅱ诱导的HSC收缩,并且降低肝纤维化小鼠肝组织中ACE1的表达,这可能是其降低门静脉高压的新发现的分子机制。第二部分卡维地洛对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化和肝窦毛细血管化的作用研究（一）目的研究卡维地洛对CCl4诱导的肝硬化模型小鼠肝纤维化和肝窦毛细血管化的影响。（二）方法1.CCl4诱导肝硬化小鼠模型的构建通过每周两次、持续8周腹腔注射CCl4构建小鼠肝硬化模型。C57BL/6小鼠被分为五组:正常对照（Control）组、橄榄油（Oil）组、CC14组、CCl4+卡维地洛（5mg/kg/d,灌胃）组、CCl4+卡维地洛（10mg/kg/d,灌胃）组。2.病理组织学检测各组小鼠肝组织石蜡切片用H＆E染色进行形态学评价,Masson染色和天狼星红染色用于评估肝组织纤维化程度。将各组肝组织石蜡切片经过一系列处理后进行免疫组化染色以检测相关血管内皮标记物。3.扫描电镜观察肝窦内皮情况取新鲜肝组织经过固定、脱水、干燥等处理后,在扫描电镜下观察各组肝窦内皮情况并拍摄图像。4.TUNEL染色和免疫荧光染色使用TUNEL染色对小鼠石蜡包埋的肝脏组织切片进行DNA片段的原位检测,从而检测细胞凋亡。用抗α-SMA的一抗和荧光偶联的二抗对HSC进行免疫荧光染色,细胞核用DAPI试剂染色,在荧光显微镜下观察并拍照。5.Luminex 分析小鼠麻醉后取全血,在室温下凝固后,离心取上层血清。按照试剂盒说明,用Luminex系统检测小鼠血清中的相关生物标志物,包括基质金属蛋白酶-8（MMP-8）、血管内皮生长因子（VEGF）和血管生成素-2（Angiopoietin-2）。6.Western blot 分析提取各组小鼠肝组织蛋白并测定蛋白浓度,用Western blot实验测定肝组织中α-SMA、Bax、Bcl-2、CD31、CD34和VWF等蛋白表达水平的变化。（三）结果1.卡维地洛减轻肝硬化模型小鼠肝组织炎症和纤维化程度。病理组织学检测结果示给予CCl4腹腔注射8周后,小鼠肝组织出现炎症细胞浸润、纤维组织增生和纤维间隔形成。卡维地洛处理后炎性细胞数量和纤维化组织明显减少,并且卡维地洛高剂量（1Omg/kg/d）组比低剂量（5mg/kg/d）组作用更明显。2.卡维地洛抑制小鼠肝组织HSC的活化、增殖并诱导细胞凋亡。免疫组化染色和Western blot分析结果示与CC14组相比,卡维地洛处理组小鼠肝组织的α-SMA表达显著降低。TUNEL染色和免疫荧光染色结果示卡维地洛处理组HSC的凋亡率高于CCl4组。另外,Western blot结果示卡维地洛处理组的肝组织中Bax蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达下降。且随着剂量的增加,卡维地洛促凋亡作用更显著（P＜0.05）。3.扫描电镜下小鼠肝组织LSEC窗孔的变化。扫描电镜结果表明,与正常对照组和Oil组相比,CCl4组小鼠肝窦LSEC窗孔的数量显著减少,而卡维地洛处理组的窗孔数量比CCl4组增加。4.卡维地洛降低肝硬化模型小鼠肝组织CD31、CD34和VWF的表达。免疫组化染色和Western blot结果表明,CD31、CD34、VWF在正常对照组和Oil组的小鼠肝组织中较少表达,在CC14组表达明显增加,而卡维地洛剂量依赖性地抑制这三个血管内皮指标的蛋白表达。5.卡维地洛降低小鼠血清MMP-8、VEGF和Angiopoietin-2的水平。Luminex检测结果示,卡维地洛处理组小鼠血清的MMP-8、VEGF和Angiopoietin-2的水平较CCl4组明显下降（P＜0.05）。（四）结论1.体内实验表明卡维地洛能够抑制小鼠肝组织中HSC的活化和增殖,减少细胞外基质沉积并减轻CCl4诱导的小鼠肝纤维化程度。2.体内实验表明卡维地洛能够通过Bcl-2家族蛋白调节的线粒体凋亡途径诱导小鼠肝组织HSC凋亡,从而缓解肝纤维化进展和降低肝内血管阻力。3.卡维地洛可以改变LSEC表型,抑制肝内血管生成并减少肝窦毛细血管化。