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目的：研究组蛋白去甲基化酶JMJD家族在激素性股骨头坏死的表达及其在成人骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用。方法：1.手术中从4例非激素性股骨头坏死患者(对照组)和6例血瘀型激素性股骨头坏死患者(坏死组)的股骨近端取出骨髓。采用密度梯度离心法提取成人骨髓间充质干细胞(hBMSCs),经过纯化、培养、传代后,取第四代(P4)的hBMSCs进行实验。首先进行hBMSCs的鉴定：采用流式细胞技术检测hBMSCs的表面抗原(CD105、 CD29、CD73、CD44、CD34、CD45、CDllb/c),观察hBMSCs的成骨分化能力(碱性磷酸酶染色和茜素红染色)和成脂分化能力(油红染色)。然后提取总RNA,分析组蛋白去甲基化酶JMJD家族的mRNA在血瘀型激素性股骨头坏死中的表达。2.正常hBMSCs购自Lonza,常规培养、传代至P5进行实验。收集正常hBMSCs成骨分化第0、3、7、14、21天的细胞,提取总RNA进行RNA-seq测序分析,提取总蛋白进行Western blot实验。构建KDM4A基因沉默和基因超表达质粒,转染293T细胞并生产相应病毒,观察沉默或超表达KDM4A后对正常hBMSCs成骨分化的影响,包括碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性检测、茜素红染色、RNA-seq测序分析、Western blot实验等。利用JMJD家族基因广谱抑制剂JIB-04,观察不同浓度的JIB-04对正常hBMSCs成骨分化的影响,包括碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性检测、茜素红染色、RNA-seq测序分析、Western blot实验等。结果：1.从患者骨髓中提取的hBMSCs的表面抗原符合hBMSCs的特征,提取hBMSCs的形态呈长梭形,具备成骨分化和成脂分化的能力。2.KDM6A和RUNX2基因mRNA的表达在血瘀型激素性股骨头坏死组明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。KDM4A、KDM4B、KDM4D的mRNA表达量随着正常hBMSCs成骨分化的进程呈现动态的降低,KDM4C、KDM5B、KDM5C、KDM6A、KDM6B、UTY的mRNA表达量随着成骨分化的进程呈现动态的升高。正常hBMSCs在成骨分化第0、3、7、14、21天KDM4A、KDM4B、KDM5A、KDM6B蛋白的表达随着成骨分化时间的增加,其蛋白表达水平逐渐增加。3.沉默KDM4A以后,无论是在常规培养基中,还是在成骨分化的培养基中,shKDM4A#1、shKDM4A#2与shNeal(对照组)相比较,差异均无统计学意义(P>0.05),说明沉默KDM4A对hBMSCs的增殖均无明显的影响；hBMSCs在成骨分化第8天的碱性磷酸酶染色,shKDM4A#1和shKDM4A#2均比shNeal明显减弱；hBMSCs在成骨分化第8天的碱性磷酸酶活性,shKDM4A#1、shKDM4A#2与shNeal相比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。说明沉默KDM4A后,hBMSCs成骨分化第8天的碱性磷酸酶染色和活性均受到明显的抑制；hBMSCs在成骨分化第14天的茜素红染色,shKDM4A#1和shKDM4A#2均比shNeal明显减弱,说明沉默KDM4A后,hBMSCs成骨分化的晚期矿化受到了明显的抑制。RNA-seq结果显示,沉默KDM4A以后,shKDM4A#1、shKDM4A#2与shNeal相比较,RUNX2、SPP1(OPN)、ALP等基因的mRNA表达明显降低,这些基因相应蛋白的表达水平也相应的降低。超表达KDM4A以后,hBMSCs在成骨分化第8天的碱性磷酸酶染色,KDM4A组(野生型)和KDM4AH188A组(突变型)均比Vector组(对照组)明显增强；hBMSCs在成骨分化第8天的碱性磷酸酶活性,KDM4A组、KDM4AH188A组与Vector组相比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。说明超表达KDM4A后,hBMSCs成骨分化第8天的碱性磷酸酶染色和活性均明显地升高；hBMSCs在成骨分化第14天的茜素红染色,KDM4A组和KDM4AH188A组均比Vector组明显增强,说明超表达KDM4A可促进hBMSCs成骨分化的晚期矿化。Western blot的结果显示超表达KDM4A以后,KDM4A组、KDM4AH188A组与Vector组相比较,RUNX2和OPN蛋白的表达均升高了。4.在成骨分化培养基中,与对照组(DMSO)相比较,800nM的JIB-04抑制hBMSCs的增殖,差异有统计学意义(P<0.05)；100nM、200nM、400nM的JIB-04对hBMSCs的增殖无影响,差异无统计学意义(P>0.05)。hBMSCs在成骨分化第8天的碱性磷酸酶染色,50nM、100nM、200nM、400nM、800nM的JIB-04均比对照组明显减弱,JIB-04浓度越高,碱性磷酸酶染色越弱；hBMSCs在成骨分化第8天的碱性磷酸酶活性,50nM、100nM、200nM、400nM、800nM的JIB-04均比对照组明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05),JIB-04浓度越高,碱性磷酸酶活性越低。hBMSCs在成骨分化第16、19、21天的茜素红染色,50nM、100nM、200nM、 400nM、800nM的JIB-04均比对照组明显减弱,JIB-04浓度越高,茜素红染色越弱。RNA-seq结果显示,100nM、400nM的JIB-04与对照组相比较,RUNX2、SPP1(OPN)、ALP等基因的mRNA表达明显降低,RUNX2和OPN蛋白的表达水平也相应的降低。结论：KDM6A可能与血瘀型激素性股骨头坏死发病机制有关。KMD4A是成人骨髓间充质干细胞的成骨分化的重要调控基因,主要通过RUNX2-OPN/ALP信号通路调节成骨分化。JIB-04通过RUNX2-OPN信号通路抑制成人骨髓间充质干细胞的成骨分化,JMJD家族基因的整体功能与成人骨髓间充质干细胞的成骨分化密切相关。