[研究背景]肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension, PAH)表现为静息时平均肺动脉压大于25mmHg或运动时大于30mmHg,肺血管阻力大于3Wood单位。PAH的主要病因是肺小动脉原发病变而导致肺动脉阻力增加,最终可导致患者右心衰竭而死亡。业已证明,PAH时肺动脉阻力增高的主要原因是肺血管重构导致肺动脉腔隙狭窄,而肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs)的过度增殖是引起血管重构的关键因素。凝集素样氧化性低密度脂蛋白受体-1(lectin-like oxidized low density lipoprotein recepter-1, LOX-1)在多种心血管疾病(包括动脉粥样硬化和高血压心血管重构)的发生与发展中起重要作用。LOX-1通过氧化应激和促炎机制损伤血管内皮细胞,促进心肌细胞和血管平滑肌细胞增殖从而介导心脏、胸主动脉和肾血管重构。最新研究发现,LOX-1在培养的慢性栓塞性肺动脉高压患者PASMCs中表达增加,可能介导C反应蛋白所诱导的PASMCs增殖。但LOX-1在低氧PAH血管重构中的作用及机制目前仍不清楚。因此,本研究拟在低氧诱导的PAH大鼠模型及原代PASMCs模型,探讨LOX-1是否介导低氧诱导PAH肺血管重构,并进一步探讨该作用是否与其促PASMCs增殖有关。[方法](1)在体实验：180～220g SD大鼠,采用低氧仓(10%02)饲养3周诱导低氧PAH大鼠模型。右颈外静脉插管测定右心室收缩压(RVSP)、平均肺动脉压(mPAP)。分离右心室(RV)、左心室加室间隔(LV+IS)并称重,计算RV/(LV+IS)比值。ELISA法检测大鼠血浆中sLOX-1水平；提取肺动脉总RNA或蛋白,real-time PCR或Western Blot检测LOX-1、Ki-67、PCNA mRNA或蛋白表达；4%多聚甲醛固定肺组织,石蜡包埋,进行HE染色或LOX-1免疫组化染色。(2)细胞实验：大鼠原代PASMCs采用组织块贴壁法制备,取第3代细胞进行a-actin免疫组化鉴定细胞。3-6代用于后续实验。低氧(3%02)刺激细胞增殖。(3)LOX-1中和抗体实验：采用不同浓度LOX-1中和抗体(5、10、20ng/ml)预孵育1h, real-time PCR或Western Blot检测LOX-1、Ki-67、PCNA mRNA或蛋白表达,流式细胞术检测细胞周期,MTS检测细胞增殖情况。(4)LOX-1小分子RNA干扰(siRNA)实验：当PASMCs达到60%～70%融合后,采用TurboFect转染试剂将LOX-1siRNA干扰片段瞬时转入细胞,干扰LOX-1表达,real-time PCR或Western Blot检测LOX-1mRNA或蛋白表达变化评价不同片段的干扰效率,选择最佳干扰片段及适当的浓度用于后续实验。LOX-1siRNA干扰24h后低氧处理细胞。Real-Time PCR或Western Blot检测Ki-67, PCNA mRNA或蛋白表达,流式细胞术检测细胞周期,MTS检测细胞增殖情况。[结果]1.低氧诱导PAH大鼠的RVSP、mPAP较常氧对照组显著升高,RV/(LV+IS)显著增加,右心室明显增厚,肺动脉显著重构,Ki-67及PCNA mRNA表达显著增加。2.低氧诱导PAH大鼠血浆中sLOX-1水平显著高于常氧对照组；PAH肺动脉主干部位LOX-1mRNA和蛋白表达显著增加；免疫组化显示肺小动脉LOX-1蛋白表达也显著增加。3.低氧可促进PASMCs增殖,同时可诱导LOX-1表达；LOX-1中和抗体(TS-20)及LOX-1siRNA可显著抑制低氧引起的细胞增殖。[结论]LOX-1介导低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖,参与低氧肺动脉高压肺血管重构。第二章低氧促肺动脉平滑肌细胞中LOX-1表达上调的上游机制[研究背景]LOX-1是一种多配体受体,许多因素可以导致LOX-1表达上调。我们第一章研究发现在低氧PAH时,低氧可显著上调PASMCs中LOX-1表达。但是具体机制仍不清楚。最新研究发现,microRNA-let-7g可抑制其靶基因LOX-1的表达。于是,我们推测低氧上调LOX-1表达也许通过下调let-7g表达而引起。LOX-1激活后可促进下游靶基因OCT-1与let-7g的启动子区域结合。OCT-1是一个翻译抑制因子,可以和let-7g启动子区域靶向结合后抑制let-7g的表达。因此,我们推测(?)LOX-1可能通过上调OCT-1进而抑制let-7g的表达从而进一步上调LOX-1本身的表达水平。Calpain是一种非溶酶体Ca2+依赖性半胱氨酸蛋白酶,可以被Ca2+信号途径激活,并选择性地解阮靶蛋白从而控制细胞功能如细胞骨架重构、细胞周期生长、基因表达和细胞凋亡。最新研究表明,calpain抑制剂MDL287170可明显抑制野百合碱诱导的大鼠PAH时肺血管重构。己知LOX-1可通过激活细胞内Ca2+从而上调PKC的表达,进一步上调OCT-1的表达。同时,calpain也可通过部分解阮作用导致靶蛋白PKC激活。因此,我们推测低氧PAH时,LOX-1可能通过LOX-1-calpains-PKC-OCT-1-let-7g-LOX-1途径来实现反馈调节。[方法](1)在体实验：180～220g SD大鼠,采用低氧仓(10%02)饲养3周诱导低氧PAH大鼠模型。右颈外静脉插管测定右心室收缩压(RVSP)、平均肺动脉压(mPAP)。分离右心室(RV)、左心室加室间隔(LV+IS)并称重,计算RV/(LV+IS)比值,以确定造模成功。提取肺动脉总RNA或蛋白,real-time PCR或Western Blot检测LOX-1、calpain-1、calpain-2、calpain-4、OCT-1、let-7g mRNA或蛋白的表达；(2)细胞实验：大鼠原代PASMCs采用组织块贴壁法制备,取第3代细胞进行α-actin免疫组化鉴定细胞。3-6代用于后续实验。低氧(3%O2)刺激细胞增殖；(3) Let-7g过表达实验：采用let-7g mimic瞬时转染法。当PASMCs达到70%～80%融合后,采用TurboFect转染试剂分别将let-7g mimic瞬时转入细胞。Real-TimePCR检测let-7g mRNA表达以确定转染效率,选择最佳浓度用于后续实验。PASMCs转染let-7g mimic24h后低氧处理,real-time PCR或Western Blot检测LOX-1、Ki-67、PCNA mRNA或蛋白表达,流式细胞术检测细胞周期,MTS检测细胞增殖情况；(4) PKC、LOX-1抑制实验：采用不同浓度LOX-1中和抗体(5、10、20ng/ml)或PKC抑制剂白屈菜红碱(1μM)预孵育PASMCs1h后低氧处理,real-time PCR或Western Blot检测LOX-1、calpain-1、calpain-2、calpain-4、 OCT-1、let-7g mRNA或蛋白表达；(5) LOX-1、calpain-1、calpain-2、 calpain-4、OCT-1抑制实验：采用小分子RNA干扰(siRNA)法。当PASMCs达到60%-70%融合后,采用TurboFect转染试剂分别将以上基因的siRNA干扰片段瞬时转入细胞,干扰相应基因表达,real-Time PCR或Western Blot检测相应基因mRNA或蛋白表达变化评价不同片段的转染效率,选择最佳干扰片段及适当浓度用于后续实验。siRNAs干扰24h后低氧处理细胞,real-time PCR或Western Blot检测LOX-1、calpain-1、calpain-2、calpain-4、OCT-1、let-7g mRNA或蛋白表达。[结果]1.低氧诱导PAH大鼠肺动脉及低氧诱导PASMCs中let-7g mRNA表达显著降低,let-7g mimic可显著降低低氧诱导的PASMCs增殖,同时也可显著抑制低氧诱导的LOX-1表达上调2.抑制LOX-1可显著逆转低氧引起的let-7g表达下调,LOX-1与let-7g之间存在着反馈调节；3.低氧诱导PAH大鼠肺动脉及低氧诱导PASMCs中calpain-1、calpain-2、calpain-4、OCT-1表达显著增加,抑制PKC、calpain-1、calpain-2、calpain-4、OCT-1表达后可显著逆转低氧引起的let-7g表达下调及LOX-1表达上调；4.抑制LOX-1表达后可抑制低氧引起的calpain-1、calpain-2、calpain-4、OCT-1表达上调,这些基因均参与了LOX-1-let-7g的反馈调节。[结论]低氧PAH时,低氧引起PASMCs中LOX-1表达上调的上游机制为LOX-1-calpains-PKC-OCT-1-let-7g-LOX-1反馈调节通路。第三章低氧肺动脉高压时LOX-1促肺动脉平滑肌细胞增殖的下游机制[研究背景]血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)表型具有多样性和可变性的特点。在胚胎发育过程中,VSMCs由未分化表型逐渐分化为具有成年特征的分化表型。当血管受到损伤或体外培养的VSMCs受到生长因子刺激时,VSMCs又从分化型转化为去分化型,表现为平滑肌标志基因表达下调,合成和分泌能力增强,重新获得增殖和迁移能力,导致血管壁增厚、管腔狭窄、血管顺应性降低和血管重构等。大多数平滑肌标志基因中存在一系列称为CArG盒的顺式调控元件。研究证明,CArG盒元件与血清反应因子(serum response factor, SRF)的结合对许多心肌、血管平滑肌和骨骼肌特异表达基因起重要的调节作用。但同时CArG序列作为血清反应元件(serum response element, SRE)的核心成分也是许多即刻早期反应基因(如c-fos和egr-1)表达所必须的顺式元件。因此,SRF除可激活平滑肌特异性基因外,还与细胞增殖有关。有研究发现,两条主要的信号通路可导致共转录因子和SRF结合而发挥基因表达调控作用。经典的通路是生长因子刺激使MAPK信号通路激活后导致SRF共转录因子Elk的磷酸化,最后导致细胞增殖相关基因的表达。第二条调节通路是由Rho依赖性的肌动蛋白动态改变。研究表明,通过生长因子刺激可以抑制VSMCs分化,并且同时可以发现由于生长因子依赖性的三元复合体因子(ternary complex factors, TCFs)存在,使myocardin从SRF中脱离出来。血管损伤或细胞增殖时,Elk可作为一个使myocardin从SRF中置换出来的VSMCs特异基因表达的信号抑制因子。因此,VSMCs增殖可通过以下两条途径实现：一条是通过MAPK通路导致TCF的磷酸化,而另一条是依赖于抑制MRTFs家族与SRF结合。如前所述,LOX-1可促进VSMCs和PASMCs增殖,但其促PASMCs增殖的机制尚不清楚。已知LOX-1激活后可导致下游通路的激活,其中包括：NADPH氧化酶、MAPKs (p38, ERK1/2, JNK)、PKC等。于是,我们推测在低氧刺激PASMCs时,LOX-1可能也通过激活MAPK通路中ERK1/2通路进一步导致pElk表达增加,pElk与SRF结合增多而导致c-fos表达增加；同时pElk可能也通过抑制MRTF-A信号通路从而使PASMCs从分化型向增殖型转化。我们假设,低氧PAH时LOX-1可能通过LOX-1-ERK1/2-pElk/MRTF-A-SRF-c-fos通路促进PASMCs增殖。[方法](1)在体实验：180～220g SD大鼠,采用低氧仓(10%02)饲养3周诱导低氧PAH大鼠模型。右颈外静脉插管测定右心室收缩压(RVSP)、平均肺动脉压(mPAP)。分离右心室(RV)、左心室加室间隔(LV+IS)并称重,计算RV/(LV+IS)比值,以确定造模成功。提取肺动脉总RNA或蛋白,real-time PCR或Western Blot检测pERK1/2、pElk、MRTF-A、SRF、c-fos、α-SMA mRNA或蛋白的表达；4%多聚甲醛固定肺组织,石蜡包埋,MRTF-A免疫组化染色。(2)细胞实验：大鼠原代PASMCs采用组织块贴壁法制备,取第3代细胞进行α-actin免疫组化鉴定细胞。3-6代用于后续实验。低氧(3%02)刺激细胞增殖。(3)LOX-1中和抗体实验：采用不同浓度LOX-1中和抗体(5、10、20ng/ml)预孵育细胞1h后低氧处理,real-time PCR或Western Blot检测pERK1/2、pElk、MRTF-A、SRF、c-fos、α-SMA mRNA或蛋白表达。(4) LOX-1小分子RNA干扰(siRNA)实验：当PASMCs达到60%～70%融合后,采用TurboFect转染试剂分别将LOX-1siRNA干扰片段瞬时转入细胞,干扰LOX-1表达,real-time PCR或Western Blot检测LOX-1mRNA或蛋白的表达评价不同片段转染效率,选择最佳片段的合适浓度进行后续实验。LOX-1siRNA干扰24h后低氧处理细胞,real-time PCR或Western Blot检测pERK1/2、pElk、MRTF-A、SRF、c-fos、α-SMA mRNA或蛋白表达。[结果]1.低氧诱导PAH大鼠肺动脉及低氧诱导PASMCs中pERK1/2、pE1k显著激活,SRF、c-fos表达显著增加而MRTF-A表达显著降低；同时,a-SMA在低氧诱导PAH大鼠肺动脉中表达无明显变化,但低氧诱导PASMCs可显著下调其表达；2.抑制LOX-1可显著抑制低氧引起的pERK1/2、pElk激活以及SRF、c-fos表达增加,逆转MRTF-A表达降低,但对低氧引起的PASMCs中a-SMA表达降低无显著影响。[结论]低氧PAH时,LOX-1介导低氧诱导PASMCs增殖的下游通路可能为LOX-1-ERK1/2-pElk/MRTF-A-SRF-c-fos信号通路。