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随着对肠道菌群的深入研究,越来越多的证据表明肠道菌群稳态对于维持宿主健康至关重要。肠道菌群失衡与多种疾病的发生发展密切相关,如糖尿病、肥胖、高血压性心脏病、炎症性肠炎（IBD）和癌症等。口服益生菌能够有效调节肠道菌群,对疾病的预防和治疗具有重要的应用价值。然而,口服递送的益生菌通常受到胃肠道复杂环境的侵袭,如胃酸、胆盐和酶等,这会显著降低益生菌的活性及肠道定植效率。此外,肠炎病理微环境中大量存在的活性氧（ROS）和受损的粘液层也进一步限制了益生菌在肠道的存活和定植。目前,多种材料被用于包封益生菌进行口服递送,为益生菌提供了一定的生存优势。然而,多数包封策略仅成功地保护益生菌在生理条件下免受胃肠道环境的侵袭,益生菌在肠道病理条件下的存活和定植仍然具有很大的挑战。因此,迫切需要开发新的策略赋予益生菌兼具抵抗胃肠道生理和病理环境侵袭的能力、增加其肠道定植,从而增强口服益生菌对疾病的治疗。基于此,受益生菌通常在粘液层中定植生长的启发,本课题构建了新型的益生菌递送系统。通过使用单宁酸（TA）和粘蛋白（Mucin）对益生菌（大肠杆菌Nissle 1917,EcN）进行逐层包封,成功构建了EcN@TA-Ca2+@Mucin。该系统通过抵抗胃肠道恶劣的生理环境,并自发调节结肠炎的病理微环境,有效提高了益生菌在肠道的定植,对结肠炎具有良好的治疗效果。具体研究内容如下:1、EcN@TA-Ca2+@Mucin的制备及表征通过逐层包封技术用单宁酸和粘蛋白修饰EcN,构建了EcN@TA-Ca2+@Mucin益生菌递送系统,并对其进行了相关表征。动态光散射仪（DLS）测量结果表明,涂层包封后,EcN@TA-Ca2+@Mucin的尺寸增加至1140±23.18nm,Zeta电位为-17.2±0.66 m V。透射电子显微镜（TEM）图像显示,与EcN的光滑边缘相比,EcN@TA-Ca2+@Mucin具有明显的涂层外壳,厚度约为200nm。流式细胞术和激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）的结果同样证明了涂层对EcN的成功包封。此外,细菌生长曲线和CCK-8实验结果表明,涂层包封之后并不影响EcN的活性和生长繁殖能力。2、EcN@TA-Ca2+@Mucin对体外模拟胃肠道环境的耐受性研究通过平板菌落计数、TEM、细菌活/死染色和细菌生长曲线等实验,证明了由于（TA-Mucin）涂层的存在,EcN@TA-Ca2+@Mucin可以有效抵抗胃肠道恶劣的生理环境,例如胃酸、胆盐和酶等,并且仍然保留着生长增殖的能力。流式细胞术和CLSM结果证明,EcN@TA-Ca2+@Mucin的涂层在经历胃肠道恶劣的生理环境侵袭之后仍然稳定包封在EcN表面。其次,在结肠炎等疾病的病理环境中,大量存在的ROS和受损的粘液层也不利于益生菌的生长与定植。因此进一步考察了EcN@TA-Ca2+@Mucin对体外模拟病理环境的耐受性及调节能力,如平板菌落计数、TEM、细菌活/死染色和电子自旋共振（EPR）等实验结果表明,EcN@TA-Ca2+@Mucin可以有效清除ROS,从而降低ROS对EcN的损伤。由于粘蛋白涂层可以通过氢键、二硫键等与粘液相互作用,通过平板流变仪考察了EcN@TA-Ca2+@Mucin对粘液内在性质的影响。结果证明EcN@TA-Ca2+@Mucin与粘液的相互作用可以显著增加粘液的表观粘度和储能模量,即增加了粘液的粘弹性。最后,通过视频显微镜追踪EcN@TA-Ca2+@Mucin在粘液中的运动轨迹和CLSM观察EcN@TA-Ca2+@Mucin的粘液渗透情况,证明了由于涂层的存在,EcN@TA-Ca2+@Mucin在粘液中的运动能力和渗透能力显著降低。3、EcN@TA-Ca2+@Mucin在健康小鼠肠道增强定植及安全性研究在健康小鼠中,对EcN@TA-Ca2+@Mucin的体内定植能力及安全性进行了评价。首先,平板菌落计数实验证明由于涂层的保护作用,EcN@TA-Ca2+@Mucin在小鼠肠道中的存活率显著提高,约为EcN组的10倍。通过小鼠肠道滞留实验、肠道长期定植实验和粘液3D成像实验等,证明了由于功能性涂层中的粘蛋白与粘液的同源性强相互作用,EcN@TA-Ca2+@Mucin被肠道蠕动排出体外的速度显著降低,在肠道的保留时间长达6天,具有良好的定植效果。此外,3次给药后,小鼠组织的苏木精和伊红（H＆E）染色结果、小鼠血清中的炎性因子水平、血常规、肝功能和肾功能等指标都与健康对照小鼠没有显著性差异,证明了EcN@TA-Ca2+@Mucin在高效定植的同时,无明显的毒副作用。4、EcN@TA-Ca2+@Mucin对结肠炎小鼠的治疗效果研究通过使用葡聚糖硫酸钠（DSS）构建结肠炎小鼠模型,考察了EcN@TA-Ca2+@Mucin对结肠炎小鼠的治疗效果。经过5次治疗后,EcN@TA-Ca2+@Mucin组小鼠体重迅速恢复,结肠长度与健康小鼠相似,证明了EcN@TA-Ca2+@Mucin具有良好的缓解结肠炎的效果。H＆E染色和原位末端转移酶标记技术（TUNEL）染色图像显示,EcN@TA-Ca2+@Mucin可以有效保护结肠上皮细胞免受病理损伤,减少细胞凋亡。ROS染色结果证明,EcN@TA-Ca2+@Mucin可以有效清除结肠炎部位的ROS。ZO-1蛋白和occludin-1蛋白的免疫荧光染色结果、阿利新蓝/过碘酸雪夫（AB/PAS）染色结果和肠道通透性实验结果均表明,EcN@TA-Ca2+@Mucin可以有效修复肠道屏障。另外,心肝脾肺肾的平板菌落计数和H＆E染色结果证明了EcN@TA-Ca2+@Mucin向远端器官的移位显著减少,没有造成小鼠远端器官的炎症细胞浸润。总之,本课题通过使用单宁酸和粘蛋白逐层包封EcN,构建了一个具有功能性涂层的益生菌递送系统(EcN@TA-Ca2+@Mucin)。由于涂层的存在,EcN@TA-Ca2+@Mucin不仅能有效抵抗胃酸、胆盐和酶等生理环境,还能减少肠道病理微环境中ROS对益生菌的损伤,同时增加与肠道黏膜的黏附,从而具有良好的肠道定植效果。基于此,在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中,EcN@TA-Ca2+@Mucin可以有效减少结肠组织损伤,修复病理微环境中受损的黏膜屏障,显著增加了益生菌对结肠炎的治疗效果。此外,由于粘蛋白的修饰,减少了细菌的远端易位,增强了口服递送益生菌的安全性。总之,该口服益生菌递送系统提供了一种在肠道病理微环境下增强益生菌定植和治疗的简单高效策略,有望为益生菌肠道定植治疗疾病提供一种新的视角。