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鸡传染性贫血(Chicken Infectious Anemia,CIA)又称为蓝翅病或贫血性皮炎综合征,以全身性淋巴萎缩、肌肉内呈现出血性素质为特征的免疫抑制性疾病,在全球范围内给养鸡业造成巨大的经济损失。CIA由鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CAV)引起,CAV是一种二十面体无包膜的单链DNA病毒,可通过垂直和水平传播造成宿主感染。该病毒有一个开放阅读框,只编码三种蛋白,分别为VP1蛋白、VP2蛋白和VP3蛋白。VP3蛋白因为具有促凋亡活性所以也被称之为凋亡素(apoptin),并在CAV病毒感染过程中发挥多种作用。近年来,越来越多的研究表明VP3蛋白具有选择性细胞毒性,通过聚集在细胞核中诱导各种肿瘤细胞凋亡,而在正常细胞中,VP3蛋白定位于细胞质当中导致其促凋亡活性失活。VP3诱导细胞死亡的具体机制仍不清楚,目前也没有VP3蛋白诱导细胞焦亡的相关报道,为此,本研究针对VP3蛋白在细胞中的杀伤作用及其机制开展了以下相关实验:1.CAV-VP3蛋白对细胞增殖的抑制作用。本研究通过重组腺病毒将apoptin基因插入其中,通过重组腺病毒感染HCT116细胞后表达apoptin从而发挥其生物学活性。通过结晶紫、CCK-8和流式细胞实验,发现VP3对细胞的杀伤呈明显的时间和剂量依赖性;通过激光共聚焦显微镜和透射电镜实验发现细胞出现肿胀,膜表面出现孔洞,并呈现出水泡样变化,这与经典的细胞凋亡完全不同。进一步对细胞核进行染色发现只有少量的核浓缩和核碎裂,说明只有少数细胞发生了凋亡。而细胞肿大胀圆、细胞核保持完整这与细胞焦亡的形态特征高度类似,结合流式细胞结果中Annexin V+/PI+比率升高,初步证明了VP3可能通过细胞焦亡途径介导细胞死亡。2.CAV-VP3蛋白通过线粒体途径诱导细胞焦亡。为揭示VP3诱导细胞焦亡的作用机制,采用小RNA干扰技术分别对GSDMD和GSDME进行敲降,结果发现敲降GSDND之后焦亡样细胞的数量没有明显变化,且GSDMD的上游效应蛋白caspase-1也没有被激活,而敲降GSDME之后具有焦亡形态的细胞数量大幅减少,细胞焦亡现象几乎被完全逆转,说明VP3诱导细胞焦亡是通过GSDME而不是GSDMD。以往的研究表明GSDME的上游蛋白是caspase-3,因此通过Western blot实验确定了caspase-3被激活,并且通过敲降caspase-3发现焦亡现象几乎消失了,说明caspase-3在GSDME上游发挥重要作用。接下来对caspase-3上游通路蛋白caspase-9、bax、Tom20分别敲降,最终确定了VP3是通过Tom20-bax-caspase-9-caspase-3-GSDME信号轴来调控并诱导细胞焦亡。3.CAV-VP3蛋白能激活多种程序性细胞死亡途径。通过敲降GSDME发现焦亡现象几乎被逆转了,细胞的存活率大幅升高,说明VP3介导细胞焦亡是通过GSDME蛋白,且焦亡在抑制细胞增殖作用中发挥重要作用。通过检测不同的时间点细胞凋亡和细胞焦亡的标志性蛋白,发现VP3能够同时诱导细胞焦亡和凋亡的发生,根据GSDME敲降和过表达发现这两种程序性细胞死亡方式存在相互转化,即当焦亡发生增多时凋亡受抑制,而当焦亡发生减少时能增加凋亡的发生。本研究通过对自噬小体、自噬溶酶体、线粒体和溶酶体染色,发现VP3能诱导自噬的激活,通过使用自噬抑制剂和敲降自噬关键蛋白ATG5,能够上调效应GSDME的表达并降低了细胞存活率,说明自噬在VP3介导的细胞死亡进程中起保护性作用。4.在体内验证VP3介导细胞焦亡的机制。本研究通过在裸鼠腿部接种HCT116细胞从而建立小鼠荷瘤模型,并对VP3治疗之后的样本进行相关指标的分析,TUNEL结果发现阳性细胞数量很少,即只有少数的细胞发生了凋亡,这与之前的实验结果相一致。Western blot分析了焦亡蛋白(GSDME、caspase-3、caspase-9、bax、细胞色素C、Tom20)的表达,结果与体外研究结果一致。本研究表明CAV-VP3蛋白在体内同样具有显著的抑制细胞增殖的作用,并且也通过线粒体途径触发了细胞焦亡。综上所述,本研究发现CAV-VP3蛋白通过激活活性氧(ROS)信号,启动线粒体途径活化了caspase-3,从而切割GSDME释放其具有打孔活性的N端蛋白对细胞膜打孔引发细胞焦亡。CAV-VP3蛋白能够同时诱导细胞凋亡和焦亡的发生,并且在GSDME蛋白的调控下发生转化,抑制自噬能进一步上调GSDME-N端蛋白表达,增加VP3对细胞的杀伤作用。以上研究结果确定了CAV-VP3蛋白诱导细胞焦亡机制,完善了VP3蛋白介导细胞死亡的机制,为今后进一步开发VP3蛋白奠定重要的理论基础。