【摘 要】
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再生（Regeneration）—直以来都是生命科学的研究热点,涡虫因其独特的再生能力被视作研究再生的最佳生物模型。本实验室前期研究发现,日本三角涡虫（Dugesia japonica）头部损伤再生过程中,Drp1与Mfn1的动态平衡在损伤后再生中的两个关键点,即第2天胚基的形成及第5天神经系统及组织分化的形成过程中起着决定性的作用。说明在涡虫再生的关键阶段,干细胞分化需要更多的线粒体提供能量。再
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再生（Regeneration）—直以来都是生命科学的研究热点,涡虫因其独特的再生能力被视作研究再生的最佳生物模型。本实验室前期研究发现,日本三角涡虫（Dugesia japonica）头部损伤再生过程中,Drp1与Mfn1的动态平衡在损伤后再生中的两个关键点,即第2天胚基的形成及第5天神经系统及组织分化的形成过程中起着决定性的作用。说明在涡虫再生的关键阶段,干细胞分化需要更多的线粒体提供能量。再生过程中线粒体数量的变化主要通过Drp1和Mfn1的动态平衡引发的线粒体分裂和融合完成。已有研究显示,在组织和神经再生中,Wnt/β-Catenin信号通路与线粒体分裂融合密切相关,Smed-tcf1是涡虫神经再生中的关键调节因子,与Wnt/β-Catenin信号通路也有密切关系。但涡虫再生中Wnt/β-Catenin信号通路与Drp1如何相互影响来调节细胞分裂及程序性死亡,Smed-tcf1与Wnt/β-Catenin信号通路和Drp1如何相互作用来对涡虫神经的再生进行调节,目前尚未不清楚。为了探讨Wnt/β-Catenin信号通路与Smed-tcf1在涡虫再生过程中的作用,本研究首先制备了日本三角涡虫β-Catenin多克隆抗体。以此抗体为基础,对涡虫头部损伤后再生过程中β-Catenin、与Smed-tcf1的表达变化与线粒体分裂融合蛋白之间的关系及其对日本三角涡虫再生的影响。本研究首先构建pET-28a-β-Catenin重组质粒,诱导β-Catenin原核蛋白表达,纯化重组蛋白后用于免疫小鼠制备日本三角涡虫β-Catenin多克隆抗体;接着采用qRT-PCR及Western blotting等生物学技术探究涡虫头部损伤后再生过程中β-Catenin、TCF1、Drp1及Mfn2等蛋白在基因及蛋白水平上的含量变化情况,以探究涡虫损伤后再生过程中β-Catenin、Drp1与Smed-tcf1的相互作用对再生的调控。本研究主要取得了如下结果:1.对日本三角涡虫β-Catenin蛋白通过生物信息学预测分析,该蛋白大小为78.35 kDa,等电点为5.69,预测的二级结构在肽链N端有无规则卷曲结构,蛋白不存在跨膜结构;该蛋白有27个抗原性肽段,7个表面易接近性肽段,根据其他数据的预测结果综合分析得到两条B细胞表位最佳肽段:68MVRMQKPAQR77、306DYSSNINDMQKLIK319。2.成功构建了 pET-28a-β-Catenin重组质粒,测序后基因序列与β-Catenin原序列BLAST结果为100%。3.成功制备日本三角涡虫β-Catenin多克隆抗体。ELISA检测抗体效价达到1:200 000,Western blotting结果证明制备的抗体能有效结合日本三角涡虫蛋白,所制备的抗体可用于后续试验。4.drp1和mfn2 mRNA含量在涡虫再生中第2天胚基形成和第5天神经及组织分化的形成中的表达变化,说明线粒体分裂在细胞分化中扮演着重要的角色。5.β-Catenin及Smed-tcf1 mRNA表达在涡虫再生关键时间点第2天胚基的形成及第5天神经系统的发育中同步下调,与线粒体融合蛋白Mfn2 mRNA趋势相同。激活Wnt/β-Catenin信号通路后,β-Catenin及Sred-tcf1 mRNA水平的表达在第2天及第5天均显著上调,同时drp1 mRNA含量在这一时间点显著下调,同时涡虫的再生受到明显抑制。说明涡虫头部再生过程中β-Catenin/TCF1可以调节线粒体分裂融合蛋白的表达,其表达与线粒体分裂融合的动态平衡密切相关,且直接影响涡虫的再生。.结论:本研究首次制备了日本三角涡虫β-Catenin多克隆抗体,并用该抗体进一步研究β-Catenin和Smed-tcf1如何调节线粒体分裂与融合,以及它们与Drp1和Mfh1/2之间如何相互作用奠定了基础。本研究发现日本三角涡虫再生过程中β-Catenin和Smed-tcf1的表达变化与线粒体融合蛋白Mfn2—致,而与线粒体分裂蛋白Drp1相反;激活Wnt/β-Catenin信号通路可抑制Drp1的表达,进而使涡虫再生过程的胚基形成和头部及神经系统再生发生障碍,说明β-Catenin和Smed-tcf1可以调控线粒体分裂融合的动态平衡,进而调控再生的关键步骤,Wnt/β-Catenin信号通路和Smed-tcf1在涡虫的再生过程中起着重要的作用。
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