肺癌是当今世界上威胁人类生命和健康安全最常见的恶性肿瘤,位居我国恶性肿瘤发病率和死亡率的第一位。肺癌分为两大类,分别为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)和小细胞肺癌(Small cell lung cancer),其中非小细胞肺癌占所有肺癌的80%左右,而将近70%的非小细胞肺癌患者在诊断时就已经处于晚期,5年生存率很低。尽管肺癌的诊断水平和治疗技术在不断发展,并取得了长足的进步,但是肺癌患者的发病率和死亡率仍然居高不下,现阶段的诊疗技术对肺癌患者生存期的延长和生活质量的提高效果并不理想。肿瘤是一种多基因改变、多因素参与、多阶段发展的复杂疾病。影响肺癌预后的因素很多,这些因素之间交互联系和相互影响,使得肿瘤变得更加复杂。我们研究肿瘤预后因子的目的是为了更好地认识肿瘤发展过程的规律,制定合适、有效的治疗方案,预测肿瘤患者的疗效和生存,对个体化治疗意义重大。通过干预不良的预后因子,延长肿瘤患者的生存期,改善患者的生存质量。β-arrestins起初是因介导G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor, GPCR)脱敏和内化被发现,是一类介导7跨膜受体信号通路调节的可溶性蛋白。G蛋白偶联受体激酶(G-protein-coupled receptor kinases, GRKs)特异性磷酸化激活GPCRs,募集β-arrestins至激活的受体,介导受体的脱敏、内化和信号转导等过程,GRK/β-arrestins系统是GPCR活性调节的关键。除了调控GPCR,随着研究的深入,人们发现β-arrestins参与了多种肿瘤相关的生物学过程,介导了多种肿瘤相关的细胞信号通路,例如细胞增殖和细胞凋亡通路等。β-arrestins的表达和功能异常可能在肿瘤发生发展过程中发挥重要的作用。目前有关β-arrestins在NSCLC组织中的表达以及与患者预后的关系,以及不同类型β-arrestins在NSCLC中的作用和机制研究较少,尚未形成统一的结论。除了研究β-arrestins对非小细胞肺癌患者的预后价值,本课题还将进一步探讨β-arrestins在非小细胞肺癌治疗中的作用和地位。目前,针对非小细胞肺癌的一、二线化疗方案,依然以铂类为基础。铂类属细胞周期非特异性药物,具有细胞毒性,可引起癌细胞DNA损伤。而放射治疗的基础是使细胞吸收任何形式的辐射线后,都可以与细胞内的结构发生作用,直接或间接地损伤细胞DNA。因此,DNA是放化疗治疗共同的作用靶点,如何增加肺癌细胞对放化疗的敏感性,是放化疗研究的热点问题。近年来研究发现,β-arrestinl可以直接调控细胞凋亡通路,将β-arrestinl沉默的肿瘤细胞对化疗药物引起的细胞凋亡变得非常耐受。同时,β-arrestinl在慢性应激条件下引起的DNA损伤密切相关。β-arrestinl参与细胞中多种生物学过程,在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。目前β-arrestinl在非小细胞肺癌中的表达及预后研究较少,同时β-arrestinl对DNA损伤的作用和机制尚未阐明,我们以β-arrestinl对非小细胞肺癌预后作用以及β-arrestinl对非小细胞肺癌放化疗的作用和机制为切入点,探讨β-arrestinl在非小细胞肺癌发生发展中的作用以及β-arrestinl在DNA损伤应答反应通路中的作用和机制,为非小细胞肺癌的防治提供新的思路和理论依据。第一部分β-arrestinl在非小细胞肺癌中的表达和预后价值研究研究目的1.明确β-arrestinl在非小细胞肺癌中的表达及预后价值2.探讨β-arrestinl与NF-κB共表达与非小细胞肺癌患者预后的关系3.探讨β-arrestinl状态对NF-κB通路的影响研究方法1.收集本院从2006年1月至2008年12月期间共152例接受手术治疗的非小细胞肺癌患者的石蜡切片,TNM分期在ⅠA-ⅢA,术前未接受任何治疗,包括化学药物治疗或者放射治疗。排除了术后一月内即死亡的病例,以及切缘阳性的病例。收集患者的临床资料信息包括,年龄、性别、肿瘤病理分期、分化程度、吸烟指数等。应用免疫组织化学的方法检测β-arrestinl分别在肺腺癌、肺鳞癌中的表达情况,统计分析β-arrestinl表达情况与患者临床病理参数以及预后的关系。2.另外收集本院从2008年6月至2009年12月期间115例接受手术治疗的肺腺癌患者的石蜡切片,TNM分期在IA-IV,术前末接受任何治疗,包括化学药物治疗或者放射治疗。应用免疫组织化学的方法检测β-arrestinl和NF-κB在肺腺癌中的表达情况,统计分析β-arrestinl与NF-κB共表达情况与患者临床病理参数以及预后的关系。3. Western Blot技术检测相关通路激活及蛋白表达水平。4.通过质粒转染siRNA转染技术研究β-arrestinl状态对NF-κB通路的影响。实验结果1.非小细胞肺癌中β-arrestinl表达水平及与患者预后的关系研究。肺鳞癌中β-arrestinl低表达,有些病例中甚至表达缺失。β-arrestinl表达缺失肺鳞癌患者总生存率相比对照组低,p=0.026。β-arrestinl表达缺失肺腺癌患者总生存率相比对照组低,但是肺腺癌中β-arrestinl表达完全缺失非常少见。2.我们进一步研究将肺腺癌β-arrestinl表达分为细胞核内表达和细胞质表达,进行亚组分析。肺腺癌中细胞核内高表达β-arrestinl患者总生存率相比低表达组低。而细胞核内高表达β-arrestinl患者无进展生存率相比低表达组低。细胞核内高表达p65患者相比低表达组总生存率低。细胞核内高表达p65患者无进展生存率相比低表达组低。细胞核内同时高表达β-arrestinl和p65患者总生存率相比对照组低。细胞核内同时高表达β-arrestinl和p65患者无进展生存率相比对照组低。3.细胞转染β-arrestinl质粒或者siRNA之后,加入不同浓度的顺铂进行药物干预。β-arrestinl过表达之后,NF-κB磷酸化增多。β-arrestinl敲除之后,NF-κB磷酸化减少。实验结论1.非小细胞肺癌中β-arrestinl的表达是一个独立的预后指标,尤其在肺鳞癌中β-arrestinl表达缺失,提示患者预后不良,而肺腺癌中β-arrestinl表达完全缺失比较少见。2.我们进一步的研究肺腺癌细胞核内β-arrestinl以及与NF-κB共表达的预后价值发现,细胞核内β-arrestinl高表达肺腺癌患者预后不良。相比单一β-arrestinl表达,β-arrestinl与NF-κB共表达的预后预测价值更好。3. β-arrestinl的状态与NF-κB的激活存在相关性。第二部分β-arrestinl在非小细胞肺癌治疗中的作用和机制研究研究目的1.探讨β-arrestinl状态对非小细胞肺癌放化疗的影响。2.明确β-arrestinl介导放化疗引起的DNA损伤以及细胞凋亡。3.探讨β-arrestinl对DNA损伤应答通路的调控作用。4.寻找β-arrestinl的底物分子和特异性结构域或位点。研究方法1. β-arrestinl质粒及siRNA转染细胞后,使用不同剂量的化疗药物以及放射治疗的方法,应用MTT和克隆形成实验在不同时间点检测细胞活性及细胞增殖情况。2.转染细胞后,进行化疗药物或者放射治疗,应用彗星实验检测细胞DNA损伤的情况。3.转染细胞后,进行化疗药物或者放射治疗,应用流式细胞技术以及Western Blot技术检测细胞凋亡与细胞周期阻滞情况。4.转染细胞后,进行化疗药物或者放射治疗,应用Western Blot技术检测细胞DNA损伤应答通路的激活情况。5.利用软件预测以及公共数据库检索,查找β-arrstinl与DNA损伤应答通路中相关蛋白结合的证据支持。6.利用免疫共沉淀技术检测转染后β-arrstinl与DNA损伤应答通路中相关蛋白的结合。7.对β-arrstinl与其它相关可能结合蛋白分子的典型结构域进行功能位点突变或对蛋白进行分段突变,然后用免疫共沉淀或GST PULL-DOWN方法进行验证。实验结果1.β-arrestinl质粒转染细胞后,应用化疗药物以及放射治疗干预,DNA损伤以及细胞凋亡增加,细胞增殖受到抑制。2.β-arrestinl小干扰RNA转染细胞后,应用化疗药物干预,DNA损伤以及细胞凋亡减少；经过放射治疗之后,细胞增殖受到抑制。3.β-arrestinl状态对放化疗引起的DNA损伤应答通路具有重要的影响。3-arrestinl过表达可以促进DDR通路的激活,反之抑制其激活。4.β-arrestinl敲除之后抑制ERK激活和NF-κB通路激活,细胞增殖受到抑制。5.检索查找并使用公共数据平台,包括https://www.predictprotein.org; http://swissmodel.expasy.org;http://consurf.tau.ac.il; http://www.russelllab.org; http://www.ebi.ac.uk等等,以及检索美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI),用以预测以及检验β-arrstinl与DNA损伤应答通路可能结合的相关蛋白。经过前期筛选,我们发现β-arrstinl与DNA损伤应答反应中存在结合可能的相关蛋白包括ATR,H2AX等。6.利用免疫共沉淀技术技术检测β-arrstinl转染后,β-arrstinl与ATR, H2AX之间存在结合,β-arrstinl敲除后ATR, H2AX表达减少。7.β-arrstin1敲除后,H2AX磷酸化激活减少。研究结论1.β-arrestinl介导放化疗引起的DNA损伤,过表达之后促进放化疗引起的DNA损伤和细胞凋亡。2.β-arrstinl通过介导DNA损伤应答通路,调控放化疗疗效。3.β-arrstinl介导ERK和NF-κB的激活,对细胞增殖具有重要影响。