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视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa,RP）是视网膜感光细胞渐进性死亡的一类疾病。根据其遗传特点主要分为常染色体显性、常染色体隐性、X染色体连锁（X-Link Retinitis pigmentosa,XLRP）、线粒体以及寡基因性状遗传。其中,X染色体连锁RP占所有RP病例的5%-15%,是公认的最常见、最严重的遗传性视网膜营养不良形式之一,主要表现为儿童时期视杆和视锥感光细胞退化,管状视野和严重的视力丧失。约70-90%的XLRP患者是由于RPGR（retinitis pigmentosa GTPase regulator）基因突变导致的。RPGR突变引起的视网膜变性具有较高的临床表现异质性,不同的突变位点可以引起包括视杆-视锥营养不良、视锥与视锥-视杆营养不良、萎缩性黄斑变性伴随呼吸道感染综合症RP、听力损伤,以及原发性纤毛运动障碍等症状。RPGR基因通过选择性剪接可产生多个转录本,其中RPGRORF15及RPGRex1-19为最主要的两种亚型。大部分导致疾病的变异都发生在RPGRORF15亚型的外显子中,少部分突变位于15-19外显子中,表明RPGRORF15亚型在视网膜中的重要性。在斑马鱼中rpgra基因与人类RPGRORF15亚型同源。本文应用Golden-gate TALEN（Transcription activator like effector nucleases）技术,成功构建了rpgra纯合敲除的斑马鱼模型。应用视网膜电流图（Electroretinogram,ERG）检测发现rpgra-/-5dpf（days post fertilization）斑马鱼中b波出现了显著的降低趋势,提示rpgra-/-斑马鱼早期即发生视觉功能障碍。分别对不同发育时期的斑马鱼进行苏木素伊红染色,发现从3 mpf（months post fertilization）开始,rpgra-/-斑马鱼的外节表现出明显的退化趋势,从5 mpf开始,其视网膜外核层逐渐变薄;至18 mpf,感光细胞显著减少,特别是UV视锥,提示rpgra的缺失会引起斑马鱼视网膜退行性病变。进一步对不同的视蛋白进行免疫荧光检测,发现rpgra-/-斑马鱼视杆细胞外节在发育至3 mpf时即开始变短,而视锥细胞外节在6mpf时,其红视锥外节也表现出变短趋势,且其在外丛状层及细胞核所在的胞体区域出现了错误定位。6 mpf时蓝视锥、绿视锥以及UV视虽然也表现出变短趋势,但是它们的定位并未发生变化,提示rpgra敲除会引起斑马鱼视网膜视杆-视锥的渐行性退化。为进一步确定RPGR突变导致视网膜色素变性的生理机制,本文对rpgra-/-斑马鱼中光转导通路相关因子进行检测,发现Gnat1、Grk1、Rho以及Sag的表达在4 mpf的rpgra-/-斑马鱼中即已出现了显著的下调趋势;在6 mpf rpgra-/-斑马鱼中除视杆细胞相关因子gnb1a与gnb1b外,其他视杆、视锥细胞的光转导相关蛋白均发生显著的下调趋势,进一步确定了rpgra-/-斑马鱼视网膜退化的表型,并提示RPGR突变导致视网膜感光细胞外节的光转导蛋白缺陷可能是RP发生的分子病理机制。前期研究表明,RPGR参与纤毛的形成及肌动蛋白应力丝的调节,其能与多种转运相关蛋白直接相互作用,形成转运复合体参与物质运输。在此基础上,本文分别对Rab8a与Gnb3的定位进行检测,发现二者均出现了错误定位的情况,且Rab8a的表达显著下调。应用透射电镜对感光细胞的纤毛进行检测,发现rpgra-/-斑马鱼纤毛区域出现大量异常的囊泡堆积。透射电镜结果同时关注到了敲除斑马鱼RPE层出现了脂滴的异常累积,进一步用尼罗红染色确认了rpgra-/-斑马鱼中确实存在脂滴的出现。在24 mpf rpgra-/-斑马鱼RPE平铺免疫荧光染色发现,RPE形态结构肿胀且较为紊乱。接着通过转录组测序分析发现脂质代谢相关的信号通路富集显著,提示rpgra敲除如何导致RPE层脂滴累积的原因可能直接与脂质氧化等过程有关。综上所述,本论文首次应用基因编辑技术构建了rpgra敲除的斑马鱼模型,rpgra-/-斑马鱼表现出类似人类的XLRP的表型。斑马鱼中Rpgr突变导致纤毛运输障碍,无法正常转运视杆视锥外节中重要的光转导蛋白以及相关蛋白,导致感光细胞膜盘缺陷,感光细胞发生凋亡进而导致感光细胞退化。敲除斑马鱼RPE层出现脂滴异常累积且其形态发生改变。该疾病模型的建立,不仅为阐明RPGR突变引起的视网膜变性的新的病理机制,也为尝试该病的治疗药物筛选研究,探索针对视网膜变性这一重要眼科疾病的有效预防和治疗手段打下了扎实的基础。