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研究背景及目的调节性T细胞(Treg)可抑制免疫效应细胞功能导致肿瘤细胞逃离宿主免疫系统的识别清除。NK细胞为天然免疫细胞,具有较高的杀伤肿瘤活性,不需抗原刺激即可发挥杀伤功能,是免疫监视的重要组成部分。NKG2D是]NK细胞的活化性受体,当肿瘤细胞入侵机体时,可识别肿瘤细胞表面表达的NKG2D配体(NKG2DLs)并介导NK细胞发挥杀伤肿瘤细胞活性。研究表明转移性黑色素瘤患者外周血中CD4+CD25+Treg细胞百分比与NK细胞毒活性以及NKG2D表达水平呈负相关。此外,黑色素瘤小鼠模型中,Treg细胞显著抑制NKG2D介导的NK细胞毒活性。课题组前期研究表明,结直肠癌患者的外周血中CD4+CD25+Treg细胞数量显著增加,而NK细胞膜表面受体NKG2D表达水平显著降低。然而,Treg细胞在外周血中是否能够通过下调NKG2D表达抑制NK细胞毒活性及潜在的调控机制尚不清楚。细胞因子(例如TGF-β和IL-10)和细胞接触依赖性机制可介导Treg细胞的抑制作用。转化生长因子-β(TGF-β)是一种抑制性细胞因子,可介导Treg细胞发挥免疫抑制作用。宫颈癌患者外周血和黑色素瘤小鼠脾脏中分离的Treg细胞可通过TGF-β途径降低NK细胞毒活性。白细胞介素-10(IL-10)是一种关键抗炎细胞因子,可由活化的Treg细胞产生,研究表明IL-10可调节黑色素瘤细胞表面NKG2D配体表达水平和NK细胞毒活性。还有研究表明,头颈部鳞状细胞癌患者外周血中CD4+CD25+ Treg细胞通过细胞接触机制抑制CD3+CD4+T细胞毒活性。然而,人外周血Treg细胞是否通过分泌细胞因子TGF-β和IL-10以及细胞接触依赖机制抑制NKG2D介导的NK细胞毒活性尚不清楚。因此本研究旨在探讨人外周血CD4+CD25+Treg细胞是否能抑制NKG2D介导的NK细胞毒活性以及细胞因子TGF-β和IL-10及细胞接触依赖机制是否介导此过程。研究方法1.NKG2D的调节功能研究:在纯化NK细胞和靶细胞(人结直肠癌细胞株HT29细胞或人白血病细胞株K562细胞)共培养系统中加入抗NKG2D中和抗体或对照IgG封闭NK细胞膜上活化性受体NKG2D,检测抗NKG2D组和对照组NK细胞的细胞毒作用(非放射性细胞毒性测定)和IFN-γ浓度(ELISA检测)、CD107a(流式细胞术)的表达水平评估NK细胞毒活性。2.TGF-β和IL-10调节功能研究:经免疫磁珠分离纯化的CD4+CD25+Treg细胞和NK细胞与靶细胞(HT29细胞或K562细胞)共培养系统中分别加入抗TGF-β中和抗体、抗IL-10中和抗体或对照IgG(分为抗TGF-β组、抗IL-10组和对照IgG组),共培养24h后检测NK细胞毒作用和IFN-y、CD107a的表达水平评估NK细胞毒活性,同时采用流式细胞术检测NK细胞表面NKG2D的表达水平。3.细胞接触依赖机制研究:将CD4+CD25+Treg细胞加入Transwell小室的上室,NK细胞与靶细胞(HT29细胞或K562细胞)在下室(非接触组),同时设置接触组,即将CD4+CD25+Treg细胞、NK细胞和靶细胞(HT29细胞或K562细胞)均放入下室,共培养24h后检测NK细胞毒活性和NKG2D的表达水平。结果1.封闭NKG2D受体可降低NK细胞毒活性。抗NKG2D组NKG2D受体水平显著低于对照组(HT29细胞:51.37±3.93%vs 21.13±2.32%,p=0.003;K562细胞:42.66±3.54%vs 25.59±2.56%,p=0.021),提示抗NKG2D中和抗体可起到阻断作用。抗NKG2D组NK细胞毒作用及IFN-γ浓度显著低于对照组(HT29细胞:P=0.003、0.003;K562细胞:P=0.001、0.015),同时抗NKG2D组CD107a表达水平也显著降低,与对照组相比差异具有统计学意义(HT29细胞:32.40±3.33%vs 19.3 7±2.59%,p=0.037;K562细胞:26.95±1.69%vs 19.70±0.99%,p=0.021)。2.封闭细胞因子TGF-β可增强由Treg细胞下调的NK细胞表面NKG2D表达。抗TGF-β组培养上清中TGF-β浓度显著低于对照IgG组,提示抗TGF-β中和抗体可起到阻断作用。抗TGF-β组NK细胞毒作用和IFN-γ浓度显著高于对照IgG组(HT29细胞:p=0.01、<0.001;K562细胞:p=0.001、0.002),同时抗TGF-β组CD107a表达水平也显著升高,与对照IgG组相比差异具有统计学意义(HT29细胞:12.29±2.02%vs 5.31±0.47%,p=0.028;K562 细胞:17.29±0.70%vs 8.32±0.82%,p=0.001)。NKG2D流式细胞术结果显示抗TGF-β组NKG2D的表达水平显著高于对照IgG组,差异具有统计学意义(HT29细胞:19.57±1.59%vs 12.80±1.33%,p=0.031;K562细胞:22.84±1.82%vs 13.85±1.43%,p=0.018)。3.封闭细胞因子IL-10也可增强由Treg细胞下调的NK细胞表面NKG2D表达。ELISA检测IL-10的浓度显示抗IL-10组的IL-10浓度显著低于对照IgG组,提示抗IL-10中和抗体可起到阻断作用。抗IL-10组NK细胞毒作用和IFN-γ浓度相对于对照IgG组显著升高(HT29细胞:p=0.08、<0.0001;K562细胞:p=0.001、p=0.030)。抗IL-10组CD107a表达水平显著高于对照IgG组,差异具有统计学意义(HT29细胞:7.70±0.32%vs 5.31±0.43%,p-=0.014;K562细胞;12.90±0.40%vs 8.32±0.82%,p=0.007)。同时抗IL-10组NKG2D表达水平也显著高于对照IgG组(HT29细胞:18.97±1.00%vs 12.80±1.33%,p=0.02;K562细胞:18.14±032%vs 13.85±1.43%,p=0.043)。4.CD4+CD25+Treg细胞通过细胞接触依赖性机制抑制NKG2D介导的NK细胞毒活性。Transwell实验显示非接触组中IFN-γ浓度显著高于接触组(HT29细胞:p=0.022;K562细胞:p=0.005),流式细胞术结果显示非接触组CD107a表达水平显著增加,与接触组相比差异具有统计学意义(HT29细胞:5.94±±0.61%vs 3.43±0.40%,p=0.025;K562细胞:10.37±0.88%vs 6.05±1.07%,p=0.036),并且非接触组NKG2D表达水平也显著高于接触组(HT29细胞:17.27±1.11%vs 11.10±0.80%,p=0.011;K562细胞:16.18±0.29%vs 11.0±1.40%,p=0.022)。结论活化性受体NKG2D可介导外周血NK细胞毒活性,CD4+CD25+ Treg细胞通过分泌TGF-β和IL-10及细胞接触依赖机制抑制NKG2D介导的NK细胞毒活性。