论文部分内容阅读
[目的]莱菔硫烷(SFN)是一种广泛存在于十字花科植物的异硫酸氰盐,在肾、脑、肠等脏器的缺血再灌注损伤中表现出保护作用,但其在肝脏热缺血再灌注损伤中的作用尚未见相关研究报道,本研究通过建立大鼠肝热缺血再灌注损伤模型,用SFN对大鼠进行预处理,分析大鼠肝脏缺血再灌注后Nrf2-ARE信号通路相关蛋白分子、血清转氨酶、凋亡调控相关因子、组织病理学变化,探讨莱菔硫烷对大鼠肝脏热缺血再灌注损伤的保护作用及保护作用机制,为临床减轻肝脏缺血再灌注损伤提供新的思路与治疗方法。[方法]1.采用Nauta RJ介绍的方法操作,建立70%肝脏热缺血再灌注损伤模型。2.SPF级健康成年雄性SD大鼠48只,体重250-280g,被随机分为3组,分别为假手术组(SO)组、缺血再灌注组(IR)、莱菔硫烷预处理组(SFN),IR组、SFN组的肝门阻断时间均为60min,每组按门静脉复流时间不同分为6h、24h两个亚组,即S06h、 SO24h, IR6h、IR24h、SFN6h、SFN24h,(各亚组n=8),SO组术前不予注射试剂,仅常规进腹后游离肝十二指肠韧带至门静脉显露,然后常规关腹;IR组为阳性对照组,术前1h每只大鼠予生理盐水0.5ml腹腔注射(ip),然后行肝缺血再灌注;SFN组为莱菔硫烷(SFN)干预组:术前1h每只大鼠予SFN5mg/kg, ip, SFN用生理盐水稀释定容至0.5ml,然后行肝缺血再灌注。各组动物经缺血再灌注后处死,腹主动取血5ml及获取新鲜肝组织,检测血清ALT、AST评价肝功能,Western blot检测肝组织Bcl-2、Bax与胞核中的Nrf2蛋白表达情况,Caspase-3活性测定试剂盒检测肝组织caspase-3活性,Tunnel染色法原位观察肝细胞凋亡情况,肝组织常规切片HE染色后观察肝细胞受损程度。[结果]1、共成功制作大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型48例;2、血清ALT和AST水平:与SO组比较,IR6h、24h、SFN6h亚组血清AST、ALT水平均明显高于SO组相同时间点亚组,差异有统计学意义(p<0.05); SFN24h亚组血清AST、ALT稍高于S024h亚组,差异无统计学意义(p>0.05);与IR组比较,SFN6h、24h亚组血清AST、ALT明显低于IR组相同时间位点亚组,差异有统计学意义(p<0.05);组内亚组间比较,S06h和S024h亚组血清ALT、AST比较差异无统计学意义(p>0.05),IR组和SFN组6h亚组血清ALT、AST明显高于24h亚组,差异有统计学意义(p<0.05)。3、Casapase-3活性:与SO组相比,IR, SFN组内各亚组Caspase-3活性均高于SO组相同时间点亚组,差异有统计学意义(p<0.05),与IR组比较,SFN6h、24h亚组明显低于IR组中相同时间点亚组,差异有统计学意义(p<0.05);组内亚组间比较,S06h与S024h差异无统计学意义(p>0.05), SFN, IR组均为6h亚组高于24h亚组,差异有统计学意义(p<0.05)。4、Western blot结果:(1)胞核中Nrf2蛋白:与SO组相比,SFN6h、24h明显高于SO组相同时间点亚组,差异有统计学意义(p<0.05), IR6h、24h稍高于SO组相同时间亚组,差异无统计学意义(p>0.05),与IR组相比,SFN6h、24h亚组均明显高于IR组相同时间亚组,差异有统计学意义(p<0.05);组内亚组间比较发现,SO组与IR组均为6h亚组稍高于24h亚组,差异无统计学意义(p>0.05),SFN6h高于SFN24h亚组,差异有统计学意义(p<0.05);(2)肝组织Bcl-2蛋白:与SO组相比,SFN6h、24h明显高于SO组相同时间点亚组,差异有统计学意义(p<0.05), IR6h、24h稍高于SO相同时间点亚组,但差异无统计学意义(p>0.05),与IR组相比,SFN6h、24h亚组明显高于IR组相同时间点亚组(p<0.05);组内亚组间比较发现,SO组与IR组均为6h亚组稍高于24h亚组,差异无统计学意义(p>0.05), SFN6h明显高于SFN24h亚组,差异有统计学意义(p<0.05);(3)肝组织Bax蛋白:与SO组相比,IR6、IR24明显高于SO相同时间点亚组,差异有统计学意义(p<0.05);SFN6h、SFN24h稍高于SO组相同时间点亚组,但差异无统计学意义(p>0.05);与IR组相比,SFN6h、24h亚组明显低于IR组相同时间点亚组,差异有统计学意义(p<0.05);组内亚组间比较发现,SO组与SFN组均为24亚组稍高于6h亚组,IR6h稍高于IR24h,但差异均无统计学意义(p>0.05)。(4) Bcl-2/Bax:与SO组相比,IR6h、24h明显低于SO组相同时间点亚组,差异有统计学意义(p<0.05), SFN6h、24h明显高于SO组相同时间点亚组,差异有统计学意义(p<0.05),与IR组相比,SFN6h、24h亚组明显高于IR组相同时间点亚组。差异有统计学意义(p<0.05);组内亚组间比较,SO组与IR组均为24h亚组稍高于6h亚组,但差异无统计学意义(p>0.05), SFN6h高于SFN24h亚组(p<0.05)。5、凋亡指数:与SO组相比,IR组与SFN组各亚组均高于SO相同时间点亚组,差异有统计学意义(p<0.05),与IR组相比,SFN6h、24h均明显低于IR组相同时间点亚组,差异有统计学意义(p<0.05);组内亚组间比较,S024h稍高于S06h,但差异无统计学意义(p>0.05),IR组与SFN组的6h亚组明显高于24h,差异有统计学意义(p<0.05);6、组织病理学结果:S06h组与S024h组肝细胞正常,无变性或坏死,肝小叶结构清楚,仅见少许炎症细胞浸润;IR6h组和IR24h组肝小叶结构紊乱,肝细胞广泛水肿,不同程度空泡样变性,部分肝细胞灶状坏死,嗜酸性增加;而SFN6h组和SFN24h组肝细胞损伤较轻,肝小叶结构基本正常,肝细胞及汇管区大部分正常,仅少数肝细胞轻度水肿,炎症细胞浸润较IR组少。[结论]1、大鼠肝脏热缺血再灌注模型是一种稳定、可靠、简便的动物模型,可操作性强;2、肝脏热缺血再灌注损伤可导致肝细胞凋亡,SFN预处理可抑制HIRI引起的肝细胞凋亡,SFN抑制凋亡的机制可能为上调Bcl-2表达、抑制Bax表达与Caspase-3活性、提高Bcl-2/Bax比例。3、激活Nrf2-ARE通路、抑制凋亡可能是SFN减轻大鼠肝脏热缺血再灌注损伤的机制。