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β-胡萝卜素是一种橘黄色的脂溶性天然色素。作为类胡萝卜素家族中的典型代表,摄入人体后转变成维生素A,因此被称为维生素A原。它具有抗氧化、抗癌及提高人体免疫力等重要的生理功能。目前,天然β-胡萝卜素作为优质的食品着色剂和营养增补剂主要被用于食品、饲料和保健品等领域,但天然β-胡萝卜素产量较低,使其应用受到限制。因此本文尝试调控产β-胡萝卜素的酿酒酵母基因工程菌株的代谢途径,希望通过抑制β-胡萝卜素合成途径中的代谢旁路来增加前体物质的供给,从而促进β-胡萝卜素的合成。同时尝试对酿酒酵母基因工程菌株的培养后期细胞进行氮素饥饿处理,来探讨提高β-胡萝卜素产量的可能性。主要开展了如下三个方面的研究。1.降低乙醇发酵产量,提高β-胡萝卜素产量及发酵的可持续性利用基因敲除技术,对用于整合β-胡萝卜素合成相关基因的原始菌株(W)的乙醇合成关键基因ADH1敲除后,使细胞直径增大了 0.32倍,而在整合了 β-胡萝卜素合成相关基因的出发菌株(C)中敲除ADH1,所获得工程菌株(C-A1)的细胞体积与出发菌株C无明显差异。利用HSGC-FID检测乙醇合成情况,发现β-胡萝卜素合成相关基因在酿酒酵母中表达,使C中乙醇产量较W上升了 9.8%,为4.03 mg/mL,而敲除ADH1能够有效抑制乙醇合成,与C相比,C-A1中乙醇合成降低了 50.1%。随着发酵时间的延长,C-A1在发酵后期菌体颜色趋近于橙黄色,且细胞内类胡萝卜素荧光点数目比C增多。在YPD中C-A1的β-胡萝卜素产量为2.98μg/mgDCW,较C提高了 17.0%,番茄红素无明显变化,约为1.40 μg/mg DCW;C-A及C发酵7天均不产生番茄红素。2.降低麦角固醇含量,提高前体物质对β-胡萝卜素合成的供给通过敲除C麦角固醇合成途径末端的非必需基因ERG3、ERG4及ERG5,构建了三株工程菌C-E3、C-E4及C-E5,其中C-E3具有低温敏感性,而C-E4及C-E5生长良好。C-E3及C-E4比出发菌株细胞直径分别增大了 0.20倍和0.15倍。通过液相检测麦角固醇含量,发现在酿酒酵母中表达β-胡萝卜素合成相关基因,C细胞内麦角固醇含量比W升高14.6%,为11.54 μg/mgDCW,而三株麦角固醇合成基因敲除的工程菌细胞内几乎都不含麦角固醇,且β-胡萝卜素合成量各有差异。YPD发酵培养,C-E3的β-胡萝卜素产量为2.74 μg/mg DCW,较C提高了 7.2%。C-E4及C-E5细胞内β-胡萝卜素含量均不高,产量为2.21μg/mgDCW及1.85μg/mgDCW,与C相比,降低了 16.9%和27.9%,但总类胡萝卜素均有所提高。对比β-胡萝卜素变化量,选择ERG3作为降低麦角固醇合成的关键基因。通过回补ERG3到工程菌株C-E3,再利用常规方法敲除ADH1后,剔除回补质粒,成功获得双敲除菌株C-E3A1。C-E3A1与C-E3一样,其生长对低温较为敏感,细胞内不产生麦角固醇,且该菌株细胞体积增大显著,直径为C的1.50倍,比C-E3增大了约0.27倍。C-E3A1在发酵后期呈现橘黄色,细胞内类胡萝卜素荧光点密集分布于整个细胞,在YPD中发酵,其β-胡萝卜素产值达到3.75 μg/mg DCW,比C及C-E3和C-A1分别提高了 40.7%,46.3%和28.9%,且总类胡萝卜素是出发菌株的2.08倍,比C-E3及C-A1 分别提高了 37.7%和 90.8%。3.氮素饥俄促进β-胡萝卜素合成微生物发酵产物的生成除受基因调控之外,也显著受生长条件的影响。有证据显示对酵母发酵后期细胞进行氮素饥饿处理,可促进细胞合成大量脂滴,同时促进麦角固醇合成。氮素饥俄处理后W麦角固醇含量高达17.16 μg/mg DCW,比YPD培养同样时间增加了 34.0%;而C及C-A1细胞中麦角固醇含量仅为13.93 μg/mg DCW及12.19 μg/mg DCW,比YPD培养同样时间仅增加3.1%和6.9%,且分别比W低18.8%和27.8%。酵母细胞整合β-胡萝卜素合成基因后使YPD培养细胞产生更多麦角固醇,然而对发酵后期细胞氮素饥饿处理,麦角固醇的合成却受到抑制,可能为高效合成β-胡萝卜素等在物质上做准备。氮素饥俄处理产β-胡萝卜素酵母细胞,菌体颜色都变深,且细胞内类胡萝卜素荧光强度均增加。此时C中β-胡萝卜素产量达到4.49 μg/mg DCW,比YPD培养同样时间增长了 68.2%,不产生番茄红素;C-E3的β-胡萝卜素产量为3.59 μg/mg DCW比YPD培养同样时间提高了 40.2%;C-E3A1细胞中β-胡萝卜素较YPD培养同样时间提高32.0%,含量为5.07μg/mgDCW;工程菌株C-A1增产最为明显,达到了 5.59μg/mg DCW,相比YPD培养同样时间增加了 92.1%。脂滴作为β-胡萝卜素的载体,单纯增加其含量,对产β-胡萝卜素的促进作用可能很小,而氮素饥饿诱导一方面促进β-胡萝卜素合成,另一方面使脂滴大量积累,从而β-胡萝卜素得以有效增产。