慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉(Chronic rhinosinusitis with nasal polyps,CRSw NP)是耳鼻咽喉科较为常见的鼻-鼻窦疾病,流行病学大规模统计显示人群中发病率约为1%-4%。目前的主要治疗手段包括糖皮质激素全身和局部应用以及手术治疗。随着功能性鼻内镜技术的进展,手术对于治疗CRSw NP具有良好的疗效,可以有效的缓解患者的痛苦,提高生活质量。然而,近年来不断有文献报道,尽管鼻内镜手术的设备与技术日益完善,但多中心的临床研究表明CRSw NP手术后仍具有较高的复发率,往往需要多次接受鼻窦内窥镜手术,给患者本人以及社会带来了沉重的经济负担。由于CRSw NP的发病机制尚未阐明,因而对于CRSw NP的保守治疗主要依靠糖皮质激素的局部和全身应用。因而,探讨CRSw NP的发病机制,找到相应的治疗靶点,达到精准治疗的目的是目前研究的方向与热点。既往研究表明,CRSw NP的病理变化包括上皮层的增厚和破坏、腺体增生,基底膜增厚、组织的水肿以及大量炎症细胞的浸润[1]。研究者对中鼻道进行研究发现,中鼻道的血流量远远小于下鼻道的血流量,血液流变学的变化与氧含量变化成正相关,因而他们认为中鼻道是相对低氧的微环境。[2]因而推测炎症对于鼻黏膜的刺激会导致组织水肿,窦口黏膜的水肿导致窦口阻塞,使得吸入鼻道内的常氧浓度的气流不能进入窦口而导致窦内低氧[3];与鼻窦组织黏膜的低氧相关的标志物如乏氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α),骨桥蛋白等,均在鼻息肉组织中发现上调[4,5],也间接证明了CRSw NP患者的中鼻道内低氧存在。上述的研究表明:CRSw NP的发生被与乏氧密切相关。但低氧如何导致CRSw NP的发生尚不清楚。HIF1α与HIF2α是一种在正常细胞中持续表达和转录的蛋白[6],但在常氧下会被蛋白酶经泛素化途径降解,低氧状态下HIF1α与HIF2α降解受阻而大量累积[7],因而HIF1α与HIF2α的表达被认为与低氧环境密切相关。HIF1α和HIF2α可以改变靶基因转录强度,通过与靶基因的缺氧反应元件密切结合,文献报道HIF1α可以调控超过100种基因[8]。HIF1α在CRSw NP组织中有明显的表达增高[5],而与乏氧相关的HIF1α下游调控因子VEGF也有明显的表达上调[9]。本课题将围绕低氧对于不同来源的鼻黏膜上皮细胞及鼻息肉上皮细胞免疫状态的影响,探讨HIF1α与HIF2α在息肉组织中的表达情况、对于相关炎症因子的影响,及相关调控机制进行研究。目的:探讨低氧如何对鼻黏膜上皮细胞及鼻息肉上皮细胞的免疫状态产生影响,进而研究何种调控机制参与了鼻息肉的发生发展,找出可能治疗鼻息肉的新靶点。方法:收集17例健康志愿者下鼻甲以及40名CRSw NP患者下鼻甲及鼻息肉组织。所收集的标本分为三组,对照下鼻甲组,鼻息肉下鼻甲组及鼻息肉组,鼻息肉组又依欧洲鼻窦炎鼻息肉指南(2012版)分为嗜酸性粒细胞浸润型鼻息肉组与非嗜酸性粒细胞浸润型鼻息肉组。标本取材后分为两部分,一部分应用免疫组织化学染色的方法分别对三组样本进行检测,包含白细胞介素5(interleukin 5,IL-5),干扰素γ(interferonγ,IFN-γ),胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin,TSLP),白细胞介素17A(interleukin 17A,IL-17A),白细胞介素17A受体(interleukin 17A receptor,IL-17AR),乏氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α),乏氧诱导因子2α(hypoxia inducible factor 2α,HIF-2α)。另一部分标本应用酶消化法,提取鼻黏膜上皮细胞,进行原代细胞培养,分别应用常氧和低氧刺激细胞。收集细胞上清,应用酶联免疫吸附试验(performing enzyme-linked immunosorbent assays,ELISAs)检测相应的炎症因子:IL-5,TSLP,IL-17A,以及IFN-γ。收集细胞裂解液用于蛋白免疫印迹试验(western blot)检测低氧与常氧状态HIF1α,HIF-2α的表达变化。同时应用免疫荧光和固态光源高内涵进行炎症试验,及Columbus图像分析软件对免疫荧光进行分析。并将患者的临床资料与炎症因子,HIF1α,HIF-2α表达情况统计分析。结果:免疫组织化学染色的结果,显示对照下鼻甲组和鼻息肉组上皮细胞表达HIF2α与HIF1α都有明显增强。三组之中对照组下鼻甲上皮细胞中IL-17A与IL-17AR表达量最高,而鼻息肉组在三组之中表达IL-17A与IL-17AR量最低。IL-17A与IL-17AR的表达量呈明显正相关。免疫组织化学结果显示HIF1α,HIF2α表达量与鼻息肉患者内镜评分呈正相关。HIF1α的表达量与鼻息肉患者的嗜酸性粒细胞浸润程度呈负相关。嗜酸性粒细胞浸润型鼻息肉组上皮细胞中表达IL-5,TSLP蛋白量明显高于非嗜酸性粒细胞浸润型鼻息肉组上皮细胞中两蛋白的表达量。非嗜酸性粒细胞浸润型鼻息肉组上皮细胞中表达IL-17A,IL-17AR蛋白量明显高于嗜酸性粒细胞浸润型鼻息肉组上皮细胞中两蛋白的表达程度。非嗜酸性粒细胞浸润型鼻息肉组与非嗜酸性粒细胞浸润型鼻息肉组上皮细胞中表达IFN-γ蛋白的量没有显著区别。ELISA结果显示常氧刺激下,随时间延长,各组鼻黏膜上皮细胞分泌IL-5,IFN-γ,TSLP,IL-17A没有明显变化。然而低氧刺激下,三组上皮细胞中IL-17A表达随时间变化出现差异:鼻息肉组与鼻息肉下鼻甲组上皮细胞,随低氧时间延长分泌IL-17A逐渐减少,对照下鼻甲组随低氧时间延长分泌IL-17A逐渐增加。但低氧刺激下,各组细胞随低氧时间延长,分泌IL-5,IFN-γ,TSLP蛋白量均没有显著区别。嗜酸性粒细胞浸润型鼻息肉与嗜酸性粒细胞浸润型鼻息肉的上皮细胞在接受低氧刺激时,其变化趋势与程度一致。免疫蛋白印记实验和免疫荧光固态光源高内涵分析结果显示,低氧48小时后,鼻息肉黏膜上皮细胞与常氧刺激时该细胞相比,HIF1α和HIF2α表达明显增加。我们的研究揭示出低氧刺激下,HIF1α,HIF2α表达和IL-17A分泌呈明显的时间依赖性与相关性:鼻息肉上皮细胞中,HIF1α,HIF2α随低氧时间延长表达明显增加,IL-17A随时间延长表达明显减少。然而,对照下鼻甲组HIF1α,HIF2α表达和IL-17A分泌也呈明显的时间依赖性,但是与鼻息肉组不同的是,该组中HIF1α,HIF2α表达和IL-17A分泌呈负相关。嗜酸性粒细胞浸润型鼻息肉与嗜酸性粒细胞浸润型鼻息肉的上皮细胞在接受低氧刺激时,HIF1α,HIF2α表达和IL-17A分泌的变化趋势与程度一致。结论:低氧对于鼻黏膜上皮细胞及鼻息肉上皮细胞免疫状态的改变具有重要影响。低氧刺激鼻黏膜上皮细胞,诱导HIF1α,HIF2α的表达,这些蛋白的表达随时间变化的趋势与IL-17A分泌随时间变化的趋势具有一致性。其中鼻息肉鼻黏膜上皮细胞与健康鼻黏膜上皮细胞分泌IL-17A的变化趋势相反。低氧可能通过刺激HIF1α,HIF2α的表达,调控IL-17A分泌,启动下游炎症反应,参与了鼻息肉的发生。另外鼻息肉下鼻甲组与鼻息肉组在低氧刺激下上皮细胞的变化趋势一致,但体内相同蛋白的表达存在差异,说明环境的刺激在息肉的发病中具有重要作用。这些结论为探讨鼻息肉的发病机理,临床干预提供了新颖的理论依据。