研究背景肺癌作为全球癌症死亡的最常见原因,每年超过100万人死于该病,其发病率及致死率呈上升趋势。非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)约占肺癌发病总数的80~85%,临床上以手术和(或)化放疗等综合治疗为主,一定程度上改善了患者的生存及预后。但在实际临床诊疗中,约75%的肺癌患者经确诊后均为中晚期,治疗效果不尽人意。整体来说患者的5年生存率仅为13%左右,给个人家庭和社会带来沉重的负担。大量研究表明肺癌的发生发展过程与基因突变密切相关,基因突变状态可作为靶向治疗效果的重要预测因子,因此全方位的检测肺癌患者基因突变状况是针对性治疗的关键环节。随着研究的不断深入,分子检测尤其是基因检测在肺癌中的诊疗价值逐渐凸显,成为学者们的关注和研究热点。传统基因检测技术包括突变阻滞扩增系统PCR(Amplification Refractory Mutation System PCR,ARMS-PCR),高效液相色谱、Sanger测序等技术,但无法深入研究基因组数量及种类的变化,且癌组织及血液样本提取与保存的要求较高。二代测序(Next Generation Sequencing,NGS)技术具有高通量属性,能同时检测单个组织或血液样本中大部分基因的改变,结合临床病理特征可持续监测肺癌动态及预后情况,并且对发现某些潜在的或稀有的突变位点有一定临床价值。在临床诊断过程中,基于组织的基因检测仍然是金标准。但在实际临床工作中,肿瘤组织样本获取风险高、重复活检较难和肿瘤的异质性等因素给组织样本的获取带来了挑战。体液检测较组织活检具有无侵袭性、风险低、取材方便等优势,主要包括血液、痰液、尿液等中的循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)、循环游离DNA(circulating cell-free DNA,cfDNA)、循坏肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC)与外泌体。血液标本可在组织样本难以获取时作为合适的替代选择,为肺癌的诊断、治疗及病情监测提供更加全面的基因概括。研究目的1.基于NGS技术检测肺癌组织标本的肿瘤相关基因突变及位点分布状况,分析突变基因与临床病理特征之间的关系。2.基于NGS技术检测肺癌血液标本的肿瘤相关基因突变及位点分布状况,分析突变基因与临床病理特征之间的关系。3.基于NGS技术评价肺癌组织与血液肿瘤相关基因突变的一致性。研究方法1.前瞻性纳入2017年12月至2018年7月期间就诊于唐都医院呼吸内科的肺癌患者,共获取组织样本53例,血液样本194例,组织与血液配对样本共33例。2.将盛有血液样本的EDTA抗凝管置于4℃、6000 r/min离心机中离心10分钟,在操作台内提取上清液分别置于3个2 mL离心管内;将3个2 mL离心管置于4℃、16000 r/min离心机中离心10分钟,在操作台内提取上清液于2个2 mL冻存管(Corning430659 2.0 mL外旋冻存管)中,上清液总体积不低于3 mL,用自封膜将冻存管口进行密封,储存于-80℃低温冰箱内。所有过程在2小时内完成。所有样本均在干冰冷藏下运输至上海真固有限公司实验室,用血液DNA提取分离试剂盒(艾德,中国)完成ctDNA的提取,7日内完成检测。而收集的新鲜组织标本将被置入2 mL冻存管(Corning430659 2.0 mL外旋冻存管)中,总体积不低于25mg,肿瘤细胞比例大于30.00%(将组织平均分成两半,一半用于病理活检,一半用于NGS检测。如果肿瘤细胞比例>30%,则样本纳入研究,如果<30%则剔除该研究),储存于-80℃低温冰箱内。所有组织样本经干冰冷藏运输至上海真固有限公司实验室。3.ctDNA提取依据QIAGEN QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit试剂盒操作手册提取,提取好的游离DNA含量采用Qubit?3.0荧光定量仪和Qubit dsDNA HighSensitivity assay kit测定,定量方法依据Qubit?3.0操作说明。使用Miseq测序仪对构建的DNA文库进行测序,操作流程依照Preparing Libraries for Sequencing onthe MiSeq和MiSeq System User Guide,测序读长为PE150。而组织样本提取的DNA则采用SLIMampTM Lung&Colon Cancer Hotspot Panel试剂盒(中国上海真固有限责任公司)进行DNA文库构建,包括2轮PCR,分别为靶向扩增与文库扩增。使用Qubit?3.0荧光定量仪和Qubit dsDNA High Sensitivity assay kit对DNA文库进行定量,定量方法依据Qubit?3.0操作说明。最后通过Miseq测序仪对构建的DNA文库进行测序,操作流程依照Preparing Libraries for Sequencing onthe MiSeq和MiSeq System User Guide,测序读长为PE150。NGS技术筛选出基因变异并进行注释(基因突变丰度阈值为1%且阳性reads数≥5),最后得出相应的结果。4.采用SPSS19.0软件进行数据分析,组间差异和突变基因之间的相关性行卡方检验,单因素分析结果中有统计学意义的指标采用Logistic二(多)元回归分析,一致性分析行Kappa分析。P<0.05具有统计学差异。研究结果1.肺癌组织样本肿瘤相关基因突变分析53例肺癌患者组织样本中,未发生肿瘤相关基因突变9例(9/53,16.98%),发生肿瘤相关基因突变44例(44/53,83.02%),其中发生单个基因突变的20例(20/53,37.74%),发生双基因突变的22例(22/53,41.51%),发生三个及以上基因同时突变的患者为2例(2/53,3.77%)。共检测到19种肿瘤相关基因突变,基因突变数目共71个,其中TP53基因突变数目为33个(33/71,46.48%),EGFR基因突变数目为6个(6/71,8.45%),CDKN2A基因突变数目为6个(6/71,8.45%)。肿瘤相关基因突变位点共74个,其中TP53、EGFR、CDKN2A突变位点较多。临床病理意义方面,EGFR基因突变在不同病理类型的患者中的差异具有统计学意义(χ~2=7.447,P=0.024),腺癌与鳞癌之间的差异具有统计学意义(χ~2=7.422,P=0.006),小细胞肺癌与腺癌、鳞癌之间的差异均不具有统计学意义(P值均>0.05);EGFR基因突变在不同临床分期的患者中的差异具有统计学意义(χ~2=9.272,P=0.037)。TP53和CDKN2A基因突变在不同年龄、性别、吸烟史、病理类型、分化程度、转移及临床分期之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。logistic回归分析结果显示,在病理类型中,以小细胞肺癌为参考标准,腺癌发生EGFR基因突变风险是小细胞肺癌的2.484×10~7倍,两组间的差异具有统计学意义(P=0.000);鳞癌发生EGFR基因突变风险是小细胞肺癌的2.484×10~7倍,两组间的差异具有统计学意义(P=0.000)。在临床分期中,Ⅳ期肺癌患者发生EGFR基因突变风险是Ⅲ期肺癌患者的9.091倍,两组间的差异具有统计学意义(P=0.014)。2.肺癌血液样本肿瘤相关基因突变分析194例肺癌患者血液样本中,未发生肿瘤相关基因突变33例(33/194,17.01%),发生肿瘤相关基因突变161例(161/194,82.99%),其中单个基因突变39例(39/194,20.10%),双基因突变的患者63例(63/194,32.47%),三个及以上基因同时突变59例(59/194,30.41%)。共检测到17种肿瘤相关基因,基因突变数目共407个,其中TP53基因突变数目为154个(154/407,37.84%),EGFR基因突变数目为75个(75/407,18.43%),KRAS基因突变数目为23个(23/407,5.65%)。血液肿瘤相关基因突变位点共502个,其中TP53、EGFR突变位点较多。TP53基因突变在不同病理类型中具有显著差异(P=0.001),其中小细胞肺癌较腺癌与鳞癌TP53突变发生较高;EGFR基因突变在性别、吸烟史方面具有统计学意义,尤其在女性(P=0.007)、不吸烟(P=0.034)的肺癌患者中基因突变频率较高;转移患者KRAS基因突变与非转移者之间的差异具有统计学意义(P=0.029)。其他肿瘤相关基因突变在不同年龄、性别、吸烟史、病理类型、分化程度、转移、临床分期之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。多元Logistic回归分析,TP53基因突变患者相比于未突变患者,腺癌突变风险是小细胞肺癌的0.244倍(P=0.000),鳞癌突变风险是小细胞肺癌的0.333倍(P=0.010),差异均具有统计学意义。EGFR、KRAS基因突变与性别、吸烟史、转移之间的二元Logistic回归分析,女性患者EGFR基因突变风险是男性的2.406倍(P=0.007),不吸烟者EGFR基因突变风险是吸烟者的1.938倍(P=0.035),均具有统计学意义;转移者KRAS基因突变风险是非转移者的2.654×10~8倍,具有统计学意义(P=0.000)。在TP53、EGFR、KRAS基因突变之间的相关性中,EGFR基因突变与KRAS和TP53基因突变之间均不具有相关性(P=0.165,P=0.132),KRAS基因突变与TP53基因突变之间显著相关(P=0.009)。3.肺癌组织与血液样本肿瘤相关基因突变一致性分析结合第一部分和第二部分结果,进一步分析TP53、EGFR及KRAS基因突变频率在组织与血液中的差异。TP53基因突变频率在组织与血液中的差异具有统计学意义(χ2=13.683,P=0.000),无一致性;EGFR和KRAS基因突变频率在组织与血液中的差异不具有统计学意义(χ2=2.011,0.053;P=0.156,0.818),具有一致性。突变类型中,错义突变、移码突变、剪接供体突变及剪接受体突变在组织与血液标本之间的差异均具有统计学意义(χ2=14.907,P=0.000;χ2=9.677,P=0.002;χ2=7.083,P=0.008;χ2=35.663,P=0.000),而无义突变、缺失突变、插入突变在组织与血液标本之间的差异均不具有统计学意义(χ2=0.560,P=0.454;χ2=0.890,P=0.346;χ2=0.142,P=0.707)。对组织和血液具有相同基因突变位点一致性分析,结果表明EGFR基因19号外显子Glu746Ala750del缺失突变在组织与血液之间的差异具有统计学意义(χ2=11.546,P=0.001);而TP53基因8号外显子Arg273Leu错义突变在组织与血液之间的差异无统计学意义(χ2=2.838,P=0.092)。不同临床病理特征的组织与血液样本EGFR基因突变频率比较分析显示,男性、吸烟及鳞癌患者EGFR基因突变在组织与血液样本中均具有统计学意义(χ2=5.341,P=0.021;χ2=5.768,P=0.016;χ2=6.913,P=0.009);而女性、不吸烟、腺癌及小细胞肺癌患者EGFR基因突变在组织与血液样本中的差异均无统计学意义(χ2=2.966,P=0.085;χ2=3.358,P=0.067;χ2=1.068,P=0.301;χ2=0.830,P=0.360)。在33例组织与血液配对样本中,同时存在相同基因突变16例(16/33,48.48%),无相同基因突变共17例(17/33,51.52%);其中EGFR基因突变在组织和血液样本中具有一致性(Kappa=0.338;P=0.043),KRAS基因突变在组织和血液样本中具有一致性(Kappa=0.353;P=0.038),而TP53基因突变在组织和血液样本中无一致性(Kappa=-0.124;P=0.466);1例患者组织和血液样本同时出现TP53和EGFR两个基因突变。研究结论1.肺癌组织样本中,NGS技术可有效检测组织肿瘤相关基因突变。TP53、EGFR和CDKN2A突变频率较高,占总突变基因的60%以上,其中超过80%以单基因与双基因突变为主。组织样本的EGFR基因突变可能在晚期腺癌患中更为常见,组织样本的TP53、CDKN2A基因突变在不同年龄、性别、吸烟史、病理类型、分化程度、转移及临床分期中未发现显著性差异。2.肺癌血液样本中,NGS可检测到超过80%的基因突变,多基因突变比例较大,提示基于NGS技术检测血液样本的肿瘤相关基因突变可更好揭示肿瘤发生发展过程中的基因全貌及改变。血液样本中TP53基因突变在不同病理类型中具有显著差异,其中小细胞肺癌TP53突变最为常见;血液样本EGFR基因突变在女性、不吸烟的肺癌患者中发生率较高;血液样本KRAS基因突变在发生转移的患者更为常见;血液样本的其他肿瘤相关基因突变在不同临床特征中差异不明显;血液样本TP53与KRAS基因突变具有明显相关性。3.肺癌组织与血液肿瘤相关基因突变的一致性分析中,EGFR和KRAS基因突变频率在组织与血液中具有一致性,而TP53基因突变频率无一致性;突变类型中,无义突变、缺失突变、插入突变在组织与血液样本中具有一致性,而错义突变、移码突变、剪接供体突变及剪接受体突变在组织与血液中无一致性;在组织和血液样本具有相同基因突变位点中,TP53基因8号外显子Arg273Leu错义突变在组织与血液中具有一致性,而EGFR基因19号外显子Glu746Ala750del缺失突变在组织与血液中无一致性。在不同临床病理特征的EGFR基因突变频率中,女性、不吸烟、腺癌及小细胞肺癌患者EGFR基因突变在组织与血液样本中具有一致性,而男性、吸烟及鳞癌患者EGFR基因突变在组织与血液样本中无一致性。配对样本中,组织和血液样本的肿瘤相关基因突变具有较好的一致性,以EGFR和KRAS基因突变为主。基于NGS技术检测组织样本和血液样本的肿瘤相关基因突变总体具有一致性,但是不同的肿瘤相关基因在组织样本和血液样本突变频率有所不同,血液样本较组织样本更容易检测到肿瘤相关基因的突变位点,更好的反映患者的临床病理特征。因此,同时检测组织样本和血液样本的肿瘤相关基因突变可以互相补充,更加全面发现患者基因突变状况,更好为临床决策提供依据。