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表柔红霉素是工业生产表阿霉素的重要前体，以微生物直接发酵方法生产表柔红霉素可以节省多步化学合成反应，降低成本，减少污染。柔红霉素生物合成途径的研究成果提示通过改变TDP-L-柔红糖胺生物合成中的一步，即dnmV基因编码酶的功能有可能实现将柔红霉素产生菌改造成表柔红霉素产生菌。本研究针对dnmV基因，首次利用用于基因破坏的重组质粒对柔红霉素产生菌SIPI-1482进行基因阻断，得到一株dnmV基因功能灭活的阻断突变株。通过PCR还扩增得到了三种异源C4酮基还原酶编码基因，研究了将几种还原酶基因以表达质粒形式及染色体整合形式在阻断突变株中的功能补偿情况，研究结果如下： 通过PCR，从SIPI-1482菌株基因组DNA中扩增出dnmV及其上游dnmU基因片段。经过测序和序列比对分析，和公开发表的波赛链霉菌ATCC 29050来源的该基因DNA序列同源性93.8％，DnmV氨基酸序列同源性92.5％。选择从其它抗生素产生菌中扩增功能相同但立体选择性相反的酮基还原酶基因：如从除虫链霉菌S．avermitilis中克隆得到完整的aveBIV基因，测序发现与文献发表序列同源性100％；从抗生链霉菌S．antibioticus ATCC11891中克隆得到完整的oleU基因，测序结果与文献发表序列同源性99.3％，氨基酸序列同源性97.3％；从雪白链霉菌S．niveus中克隆得到完整的novS基因，测序结果与文献发表的来源于青蓝链霉菌S．caeruleus的基因同源性为99％，氨基酸序列同源性98.6％。 分别截取dnmV基因内部470bp及716bp片段插入大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pKC1139的多克隆位点内，构建同源重组质粒pYG807、pYG809用于dnmV基因阻断，研究发现将来源于大肠杆菌的该质粒首先转化S．lividans TK24，再以TK24中提取质粒转化SIPI-1482的原生质体可以获得转化子。通过温度筛选及PCR、Southern Blotting等验证，得到一株dnmV基因的阻断突变株BF3，鉴定470bp片段长度已经满足宿主菌同源交换臂长度的要求。发酵产物分析表明BF3仍有柔红霉素产生，即在BF3中未能完全灭活dnmV基因功能。 将安普霉素抗性基因插入PCR扩增得到的dnmUV长片段中的dnmV内部，构建了用于同源重组双交换的质粒pYG817。通过将该质粒碱变性单链化以后转化SIPI-1482原生质体，筛选验证得到了一株通过双交换使dnmV基因插入失活的重组菌12#，发酵实验证明该重组菌已不能代谢产生柔红霉素，证明该重组菌中dnmV基因功能被阻断。 构建几种C4酮基还原酶基因在链霉菌中的表达质粒分别命名为pYG810、pYG812、pYG820、pYG821，使aveBIV、dnmV、oleU、novS分别处于PermE启动子控制之下。将构建所得的表达质粒导入dnmV基因阻断突变株12#菌株内，得到重组菌12#(pYG812)、12#(pYG810)、12#(pYG820)及12#(pYG821)。对比12#(pYG812)与12#及SIPI-1482发酵产物HPLC分析结果发现：12#(pYG812)恢复产生柔红霉素，但柔红霉素量较SIPI-1482降低约60％。而12#(pYG810)、12#(pYG820)及12#(pYG821)与12#及SIPI-1482发酵产