论文部分内容阅读
Pygopus2(Pygo2)是2002年发现的，为Wnt信号通路中β-catenin的下游功能蛋白。Pygo2有两个独特的保守结构域，即N端的NHD结构域和C端的锌指结构模体PHD。已有研究证明，Pygo2的PHD结构域可通过Lgs/BCL9与β-catenin结合。而NHD结构域则被认为在无PHD存在下可激活Wnt靶蛋白的转录。从整个蛋白上看，PHD与Lgs/BCL9的结合可增强基因的转录，通过以下两种方式：1)把NHD带至β-catenin/LEF转录复合体或靶基因上，推动转录的进行。2)把β-catenin锚定在核内，以提高β-catenin/LEF复合体的水平。但这些假设还需要论证。因此，我们用串联亲合层析(tandem affinity purification，TAP)技术筛选与Pygo2有相互作用的蛋白，以揭示Pygo2在Wnt信号通路中的作用过程和详尽机制。
我们构建了哺乳动物表达载体pNTAP-pygo2，使表达的Pygo2蛋白N端加上CBP-SBP串联亲合标签。重组载体转染Bcap37细胞，用G418筛选稳定表达细胞系。收获细胞裂解液，在温和的生理条件中进行两步纯化，使与Pygo2蛋白直接或间接相互作用的蛋白分子一起被纯化下来。纯化得到的蛋白经SDS-PAGE电泳和银染，发现8条特异性条带。切下蛋白带做MALDI-TOF质谱鉴定，检索蛋白数据库，得到包括CDK8和β-catenin在内的一系列蛋白。
CDK8被认为是MED复合体的一个组分。其与CycC、MED12和MED13组成的MED复合体(mediator)是一个进化保守的多蛋白复合体，介导基因特异的转录因子与RNA聚合酶Ⅱ的转录机制。
我们用TAP验证了外源Pygo2的NHD结构域与内源CDK8的相互作用。接着我们构建了哺乳动物表达载体pCMV-3×FLAG-MED12，pCMV-3×FLAG-MED13，分别与pCMV-myc-Npygo2共转染293T细胞，再次用CoIP证明，Pygo2确实与MED12和MED13有相互作用。
通过以上实验，我们推断，Pygo2可能具有双重功能，即可以将β-catenin保留在细胞核内，增强β-catenin的作用，本身也具有转录激活的功能，而其转录激活的功能很可能由其N端结构域NHD与mediator的作用来实现。但这一假设还需进一步的实验证实。
综上所述，我们用TAP和质谱技术纯化到了CDK8，并发现Pygo2与mediator的结合具有很高的可信度。这必将帮助我们了解Pygo2复杂的调节机制，同时，也为Wnt信号通路的研究带来了新的思路。