恶性肿瘤严重威胁着人类的健康,是人类死亡的主要死因之一。在全球范围内,胃癌发病率在男/女性恶性肿瘤中分别居第二、四位。胃癌是我国常见的恶性肿瘤,每年新发胃癌患者约为40万人,2005年中国胃癌发病率在男性中为37.1/10万,而且正呈不断上升趋势,死亡人数在所有恶性肿瘤中居首位。在诊断时,大多数胃癌患者已有局部淋巴结和器官的转移,对于无法手术切除的胃癌转移患者目前尚无有效的治疗手段,外科手术仍是胃癌的主要治疗手段。尽管外科手术、放疗和化疗有了很大进展,但进展期胃癌预后仍然很差,其治疗方法有限。另外,化疗毒副作用导致患者死亡和继发肿瘤发生。因此,有必要寻找一个更为有效的治疗方法。树突状细胞(DCs)是目前已知功能最强专职抗原提呈细胞,能摄取、加工和将抗原提呈给幼稚T细胞。DCs具有激活幼稚T细胞的特点,作为疫苗有效载体,已经用于肿瘤免疫治疗。随着DCs由外周血单核细胞和CD34+干细胞体外诱导分化、培养技术的建立,已使DCs疫苗应用于临床实践。肿瘤免疫治疗的一个重要进展就是DCs负载不同肿瘤抗原,如肿瘤裂解物、肽、肿瘤总RNA和肿瘤mRNA等,作为DCs疫苗诱导产生抗肿瘤免疫应答。近年来国外相继开展了用DCs疫苗治疗恶性黑色素瘤、前列腺癌、肾细胞癌、乳腺癌、肝细胞癌、宫颈癌和结直肠癌等肿瘤的Ⅰ、Ⅱ期临床试验。例如,2007年Bleaumer等报道用CA9肽和KLH负载成熟DCs治疗进展期、对细胞因子抵抗的肾细胞癌患者的Ⅰ期临床试验,结果表明患者对DCs疫苗有良好的耐受性。2006年Kyte等报道用单核细胞来源DCs转染自体肿瘤mRNA治疗恶性黑色素瘤的;2005年Yamanaka等报道用自体肿瘤裂解物负载单核细胞来源DCs治疗复发恶性胶质瘤;2006年Burgdorf等报道利用自体DCs负载肿瘤裂解物治疗进展期结直肠癌;2006年Nakai等报道利用肽或肿瘤裂解物致敏成熟的单核细胞来源DCs用于治疗对传统方法无效的恶性黑色素瘤;台湾Lee等于2005年报道用自体肿瘤裂解物负载外周血单核细胞来源DCs治疗进展期肝癌;2005年Hus等报道利用异体单核细胞来源DCs负载肿瘤裂解物或凋亡小体治疗早期B细胞慢性淋巴细胞白血病;2003年SuZ等报道利用肾肿瘤RNA转染DCs治疗转移性肾癌;2004年Caruso报道用肿瘤RNA负载单核细胞来源DCs治疗复发的脑肿瘤等等。总之,这些Ⅰ、Ⅱ期临床试验结果表明DCs疫苗治疗肿瘤是安全可行的。还有一些DCs疫苗的临床试验仍在进行,为今后改善DCs疫苗疗效奠定基础。但是,DCs疫苗治疗胃癌尚处于基础研究阶段。随着对肿瘤免疫和DCs疫苗的临床试验,将有助于我们在不久的将来找到一个更为有效的疫苗治疗肿瘤。胸腺肽α1(Tα1)在临床已广泛用于治疗慢性乙肝、丙肝和AIDS等,也辅助用于治疗非小细胞肺癌、肝癌和恶性淋巴瘤等肿瘤。已有研究表明:Tα1能影响T细胞成熟、分化和功能,促进NK细胞恢复活性,减少化疗时的肝毒性,增强机体的免疫调节作用。但Tα1对DCs的作用知之不多,2004年Huang等报道Tα1对小鼠骨髓来源DCs成熟、分化和功能具有调节作用。然而,Tα1对肿瘤患者外周血单核细胞来源DCs的作用尚未见报道,而且对于肿瘤免疫治疗联合应用Tα1也无相关报道。本研究共分以下四部分:第一部分胸腺肽α1对胃癌患者外周血单核细胞来源树突状细胞分化、成熟及免疫功能的影响目的:探讨Tα1体外对胃癌患者外周血单核细胞来源树突状细胞分化、成熟及功能的影响。方法:选择胃癌患者6例,其中女2例,男4例,均经病理检查证实为胃腺癌。利用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMCs),在体外经100ng/ml rhGM-CSF和50ng/ml rhIL-4诱导,隔天半量换液,并添加rhGM-CSF和rhIL-4,培养5天后产生不成熟DCs,第6天分为5组,其中实验组3组,分别加不同终浓度Tα1(Ⅰ组0.5ng/ml、Ⅱ组5 ng/ml、Ⅲ组50 ng/ml);阳性对照组(B组),加rhTNF-α20ng/ml;空白对照组(A组),不加rhTNF-α和Tα1;均继续培养2天。第8天,收集悬浮细胞用于体外实验。利用倒置相差显微镜观察moDCs形态;台盼蓝染色检测moDCs活力;流式细胞仪检测moDCs表型分子CD1a, CD80, CD86, CD83 and HLA-DR的表达;MTT法检测混合淋巴细胞反应中moDCs刺激T细胞增殖能力。结果:①Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组与B组相比,moDCs的形态无明显区别,细胞活力无统计学意义(P>0.05);②Tα1能上调moDCs表型CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达,与A组相比差异有统计学意义(P<0.01),但与B组相比无统计学意义(P>0.05);③Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组moDCs刺激T细胞增殖能力与Tα1呈剂量依赖性(P<0.05, P<0.01, P<0.01),均明显高于A组(P<0.01),但与B组相比无统计学意义(P>0.05),且随效靶比增加而增强。结论:Tα1能促进胃癌患者moDCs的分化、成熟和免疫功能;Tα1有可能作为一种药物,应用于促进DCs成熟;moDCs可能是Tα1体内作用的一个靶细胞。第二部分荷人胃癌皮下移植瘤及细胞免疫功能重建的裸鼠模型构建目的:探讨荷人胃癌皮下移植瘤及细胞免疫功能重建的裸鼠模型构建及其特征。方法:裸鼠饲养于SPF环境,实验前经1周检疫。人外周血T淋巴细胞利用尼龙毛柱法分离。10只4周龄裸鼠随机分为实验组(n=5):腹腔注射人外周血T淋巴细胞和皮下接种人胃癌细胞BGC-823,对照组(n=5)腹腔注射PBS和皮下接种胃癌细胞BGC-823。观察肿瘤的潜伏期、成瘤率和肿瘤体积,肿瘤大小用游标卡尺每2天测量1次。流式细胞仪检测裸鼠外周血中人源性T细胞,并观察移植物抗宿主病。MTT法检测实验组裸鼠脾T细胞的体外杀伤作用;皮下移植瘤的病理组织学检查。结果:①两组潜伏期分别为(11.2±1.9)天和(9.4±1.5)天,无统计学意义(P﹥0.05),成瘤率为100%;第4周未,两组瘤体积分别为(1495.6±111.6)mm3和(1649.6±128.0)mm3,相比无统计学意义(P﹥0.05);②第4周未,实验组鼠外周血中人CD3+、CD4+和CD8+T细胞分别为(46.86±9.14)%、(31.68±10.17)%和(17.91±1.38)%,而对照组鼠外周血中则无人T细胞;当效靶比为20:1和40:1时,实验组裸鼠脾T细胞的特异性杀伤率分别为(15.37±1.58)%和(19.86±2.86)%,且随效靶比增高而增强(P﹤0.05)。在观察期间,未发生GVHD。③两组荷瘤裸鼠均无肝、肺转移;胃癌细胞保持亲代细胞的形态学特征。结论:腹腔注射HuPBTL和皮下接种人胃癌细胞的方法成功构建人胃癌-HuPBTL-裸鼠模型,能模拟具有一定细胞免疫功能的胃癌患者的荷瘤状态,是研究胃癌DCs疫苗免疫治疗较理想的动物模型。第三部分胃癌总RNA转染树突状细胞在人源化裸鼠体内的抗肿瘤免疫作用目的:探讨树突状细胞疫苗在人源化裸鼠体内的抗胃癌免疫作用。方法:用TRIzol试剂盒提取胃癌总RNA,并对纯度、含量和完整性进行鉴定,密度梯度离心法分离PBMCs,利用体外直接混合法制备DCRNA疫苗。建立人源化裸鼠模型,30只裸鼠随机分为免疫保护组和免疫治疗组,在免疫保护组中:15只裸鼠随机分为DCRNA组、DCs组和PBS组,每组5只,分别用DCRNA、DCs和PBS皮下注射免疫2次,间隔1周,末次免疫后3天皮下接种人胃癌细胞BGC-823。在免疫治疗组中,15只裸鼠也随机分为DCRNA组、DCs组和PBS组,每组5只,皮下可触及结节时,分别用DCRNA、DCs和PBS皮下注射免疫2次,间隔1周。观察裸鼠皮下瘤的生长、体积和瘤重。用酶联免疫吸附法检测IL-12和IFN-γ水平。结果:(1)肿瘤总RNA量约600μg,总RNA未降解。(2)在免疫保护组:DCRNA组瘤体积(574.20±95.73)mm3明显小于DCs组(847.76±113.91)mm3和PBS组(969.25±131.8)mm3(P﹤0.05);DCRNA组瘤重(0.464±0.156)g明显小于DCs组(0.750±0.220)g和PBS组(1.002±0.138)g(P<0.05, P<0.01),但DCs组和PBS组差异无统计学意义(P﹥0.05),DCRNA组抑瘤率(53.7%)显著高于DCs组(25.1%)(P﹤0.05)。DCRNA组IL-12水平(387.0±53.6)pg/ml明显高于DCs组(279.2±42.7)pg/ml和PBS组(24.7±5.1)pg/m(lP﹤0.01);DCRNA组IFN-γ水平(986.4±163.7)pg/ml明显高于DCs组(713.2±121.8)pg/ml和PBS组(57.9±9.3)pg/m(lP﹤0.05, P﹤0.01)。(3)在免疫治疗组:DCRNA组瘤体积(814.7±173.6)mm3明显小于DCs组(1089.3±196.8)mm3和PBS组(1258.6±257.3)mm3(P﹤0.05),但DCs组与PBS组无统计学意义。DCRNA组瘤重(1.027±0.236)g明显小于DCs组(1.458±0.390)g和PBS组(1.679±0.358)g(P<0.05, P<0.01),但DCs组和PBS组差异无统计学意义(P﹥0.05),DCRNA组抑瘤率(38.8%)显著高于DCs组(13.2%)(P﹤0.05)。结论:DCRNA疫苗在人源化裸鼠体内能诱导产生较强的抗胃癌免疫保护及治疗作用。第四部分胸腺肽α1联合树突状细胞疫苗的抗胃癌免疫治疗作用目的:观察Tα1联合树突状细胞疫苗在人源化裸鼠体内的抗胃癌免疫作用,探讨Tα1能否提高抗肿瘤活性。方法:提取肿瘤总RNA并进行鉴定,体外直接转染DCs制备DCRNA疫苗,腹腔注射人外周血T淋巴细胞建立人源化裸鼠模型,随后20只裸鼠随机分为PBS组(Ⅰ组)、DCRNA组(Ⅱ组)、Tα1组(Ⅲ组)和Tα1联合DCRNA组(Ⅳ组),每组5只,分别用PBS、DCRNA、Tα1以及Tα1联合DCRNA皮下注射,免疫2次,间隔1周,末次免疫后第3天于裸鼠皮下接种胃癌细胞。观察荷瘤鼠的瘤体积、瘤重和抑瘤率;采用酶联免疫吸附法检测IL-12分泌水平。结果:(1)Ⅱ组、Ⅳ组的肿瘤体积分别为(814.7±173.6)mm3和(672.1±126.8)mm3,明显小于Ⅰ组(1258.6±257.3)mm(3P﹤0.05或P﹤0.01)。Ⅱ组、Ⅳ组的瘤重分别为(1.027±0.236)g和(0.758±0.223)g,明显小于Ⅰ组(1.679±0.358)g(P﹤0.01)。(2)Ⅳ组的抑瘤率(54.85%)大于其理论抑瘤率(53.99%)。(3)Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组IL-12水平分别为(387.0±53.6)pg/ml、(182.3±36.2)pg/ml和(543.9±91.8)pg/ml,均明显高于Ⅰ组(24.7±5.1)pg/ml(P﹤0.01),Ⅳ组和Ⅱ组相比差异有统计学意义(P﹤0.05)。结论:DCRNA疫苗与Tα1在人胃癌-HuPBTL-裸鼠体内均具有一定的抗肿瘤作用,Tα1与DCRNA疫苗联合应用具有协同作用,为Tα1辅助DCs疫苗用于胃癌免疫治疗的临床研究提供理论依据。