研究意义:急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是呼吸科常见且棘手的疾病之一,我国目前尚无有关 ALI/ARDS(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)患者发病率及死亡率的统计。美国统计的数据显示,每年约有150000-200000人发生ALI。最新随机调查表明,急性肺损伤患者的死亡率高达35%-40%,其中28天内死亡率达25-30%。多种原因可以导致肺等器官的损伤,严重时可以引起急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合症和(或)多器官功能障碍综合症(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)。ALI/ARDS 往往是 MODS 中最早,也是最常见出现的器官功能障碍,在MODS的整个发病过程中居重要甚至是决定性的地位。ALI/ARDS不仅病死率高,而且其病因及发病机制错综复杂,致病环节众多,已成为临床呼吸与危重病学研究的热点和难点。因此对于ALI/ARDS的研究有着重要的临床意义。ALI/ARDS具体的发病机制尚未完全阐明,目前提出有多种学说,如“炎症反应失控”,“凝血/抗凝失衡”和“氧化应激”“凋亡紊乱”等等。众所周知,炎症反应是机体对各种病理损伤和刺激产生的一种生理反应。目前多数学者认为,肺部或系统性失控的炎症反应是ALI/ARDS的主要发病机制。而且细胞因子和炎症介质是炎症反应过程中的关键因素,可相互作用,通过活化多种的信号通路,参与调控机体炎症免疫反应。早在上个世纪90年代初国内也认识到细胞因子和炎性介质的调控失衡在ALI/ARDS病情的发生发展中起重要的作用。过去10多年来,基于对ALI/ARDS中细胞因子和炎性介质调控失衡的研究取得了不小的进展,也暴露出研究中的缺陷与不足。研究在基础方面所获得的进展有揭示细胞内信号通路如:NF-κ B系统的活化、MAPK通路的激活、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)的作用参与急性肺损伤的发生发展,以期望找到有效遏制ALI炎症反应的信号通路及位点。临床研究的进展一方面旨在发现和寻找ALI/ARDS时血浆标志性蛋白,如同急性心梗时肌钙蛋白的指示作用。另一方面寻求有效抗炎治疗药物。回顾治疗急性肺损伤的基础及临床研究,我们不难发现抑制炎症初始阶段中促炎介质的释放是主旋律。但有研究发现:单独针对某个促炎介质的抗炎治疗策略(如应用特异性TNF-α或IL-1 β拮抗剂)经临床研究证实并不能改善患者的预后。已有研究证实炎症消退和炎症发生有相似之处,即:都是是一个主动和程序化的过程。炎症反应的及时消退(Inflammation resolution)是防止炎症慢性化的关键环节。而有关这种炎症消退的机制研究已逐渐成为目前研究的新热点。单独抑制某种炎性介质的效果并不成功。于是,我们期望寻找炎症反应中更为全面的研究入口,来诠释ALI/ARDS疾病过程中病理生理学的改变,那么外泌体的研究就应运而生。外泌体(Exosomes)起源于细胞内吞系统的多囊体(multivesicular body,MVB)。形成过程是:首先胞内体膜通过“逆出芽”方式向内出芽形成小囊泡,包容部分细胞浆成为多囊体;多囊体随之与细胞膜相融合,存在于其内部的囊泡结构被释放到细胞外形成外泌体。研究发现外泌体是直径为30-100nm的脂质双分子结构囊泡。有多种细胞可分泌外泌体,其中包括上皮细胞、肥大细胞、血小板、抗原提呈细胞以及肿瘤细胞等。已证实在大多数体液中均能检测到外泌体的存在,如血液、尿液、BALF、羊水、乳汁、精液、唾液、关节滑液、肿瘤腹水和恶性渗出物。体外细胞条件培养基中也存在外泌体。可以看出,外泌体可广泛存在于体液循环中。外泌体内包含miRNA、mRNA、蛋白质和脂质等不同种类的生物分子。虽然组织来源不同的外泌体成分不同,但它们也有着共同的蛋白质组分,包括四跨膜蛋白超家族、热休克蛋白、膜转运和融合相关蛋白、多囊泡胞内体产生相关蛋白等,这些成分能够反映其生物来源。除此之外,exosomes内还包含了细胞因子、转录因子受体、生长因子受体等生物活性分子。在正常或疾病状态下,这些物质在细胞中共同表达,由外泌体装载并分泌到生物体液中发挥相应的作用。外泌体有丰富的生理功能,如介导细胞信息交流、信号传导、运输遗传物质和调节免疫反应等。例如:研究发现外泌体可以通过释放内部的信号分子作用于细胞膜表面受体,完成细胞间交流。如在肿瘤细胞来源的外泌体中发现了大量细胞生长因子,如成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、血管生长素等,在酸性条件下这些成分可释放到细胞外,作用于内皮细胞膜表面受体导致血管形成,促进肿瘤生长。又如:从哮喘患者支气管肺泡灌洗液中分离得到的外泌体与正常人相比较,能更多地诱导肺泡上皮细胞分泌白三烯和IL-8的产生,而这些介质与哮喘的发病机制密切相关。另有研究证实,外泌体相关的miRNA参与调控哮喘疾病的病理生理过程等等。外泌体内包含miRNA、mRNA、蛋白质和脂质等不同种类的生物分子。还包含了细胞因子、转录因子受体、生长因子受体等生物活性分子。在正常及疾病状态下,这些物质在细胞中共同表达,由外泌体装载并分泌到生物体液中发挥相应的作用。有研究发现,由于Exosomes表面表达有CD55和CD59,可避免被调理素、补体或凝血因子激活,能在体液中稳定存在;同时又因为其体积微小(<100nm),可有效避免单核-巨噬细胞的吞噬,相对而言能较自由地穿过血管壁及细胞外基质,因此可以在体液中广泛分布。由此,我们可得知细胞因子等装载于外泌体中可以稳定且广泛地存在于体液中,拥有更长的半衰期,从而发挥丰富的生理功能,如介导细胞信息交流和调节免疫反应等。鉴于外泌体的此特点:稳定存在且广泛分布于体液循环中,介导细胞间信息交流参与调解炎症免疫反应,能否帮助我们进一步认知ALI的发病机制?细胞因子(cytokine)是由外界刺激炎性细胞而合成、分泌的一类具有多种功能的小分子蛋白质。Cytokine作为细胞间信号转导分子,主要参与免疫细胞分化发育、介导免疫应答和炎性反应、刺激造血功能和组织修复等。现如今对于细胞因子在各种疾病中的表达也有很多的报道,有关血液中细胞因子的表达谱检测在ALI/ARDS中也已有多项报道,但针对血液中外泌体内的细胞因子谱尚未有研究报道,而且现有的血清中细胞因子表达的研究中,检测指标较少,各研究间的差异较大。这对于认识血液中不同形式的细胞因子谱是不完整的,也是不全面的。本实验的研究意义在于探究外泌体在急性肺损伤中发挥的作用,从一个新的角度认知疾病的发生发展过程,更全面地诠释急性肺损伤疾病状态下细胞因子表达谱的变化。为解析疾病的发生发展机制提供新的契机。不仅如此,为后续研究急性肺损伤时外泌体中蛋白质组学以及miRNA的检测,寻找作为诊断标准的特异性标志蛋白打下基础。本课题拟用经典腹腔注射脂多糖(lipopolysaceharide,LPS)复制小鼠急性肺损伤模型。脂多糖是内毒素的主要致病成分,该模型是最早用于诱导动物急性肺损伤的模型之一。该方法技术成熟,可模拟临床中革兰阴性杆菌引起的肺损伤,可复制性强。已有研究显示:LPS通过TOLL样受体4途径激活先天免疫反应,可较好地研究宿主炎症反应。造模成功后,获取实验组不同时间点及对照组的标本,观察LPS诱导的急性肺损伤早期,肺组织病理学改变、肺组织湿干质量比值。利用优化的 ExoQuick Exosome Precipitation Solution(Cat#:EX〇Q5A-1)试剂盒的方法提取血清外泌体,获得更高纯度的外泌体供后续研究。利用多因子检测技术(multi-analyte profiling,xMAP)研究血清和血清外泌体中细胞因子谱的差异。方法:健康的6-8周C57/BL6小鼠18只,雄性,体重(20±2)g,随机分为三组:对照组6只,ALI 2h组6只,ALI 8h组6只,所有实验动物刺激前均饥饿8小时,只进水不进食。实验组小鼠腹腔注射10mg/kg的LPS,复制内毒素性小鼠急性肺损伤模型。对照组腹腔注射等量生理盐水。所有实验小鼠均在充分麻醉后分别于2h和8h提取标本,开胸采用心脏取血法提取血液标本,经离心后取上清液,-80℃冻存。利用优化的ExoQuick Exosome Precipitation Solution(Cat#:EXOQ5A-1)试剂盒的方法提取高纯度的血清外泌体,经透射电子显微镜和Western Blot验证外泌体,利用xMAP研究对照组和不同时间点实验组血清及血清外泌体中细胞因子的表达谱变化。获取肺组织标本,右肺称湿重、并于烘干后再次称重,计算湿/干重比值(W/D)。灌洗后摘取肺脏组织,置于冰上预冷的PBS中漂洗3次以充分去除残余血液,放入4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋切片,HE染色后观察肺组织病理学改变。并利用PBS、LPS和对照组及实验组提取的血清外泌体进行体外小鼠巨噬细胞株(RAW264.7)划痕实验24h验证ALI外泌体的作用。结果:1、对照组小鼠肺组织W/D为4.037±0.130,实验组2小时小鼠肺组织W/D为4.607±0.201,实验组8小时小鼠肺组织W/D为5.109±0.158。与对照组比较,实验组2小时W/D显著增高(P<0.001);与对照组比较,实验组8小时W/D显著增高(P<0.001);实验组不同时间点W/D值也有显著性差异(P<0.001)。2、肺组织病理学改变:与对照组比较,实验组肺泡壁增宽,肺泡腔内以及肺间质可见出血和渗出等炎症表现,随时间推移,肺组织损伤越来越严重,LPS刺激8h,肺组织内大量炎性细胞、红细胞以及血浆蛋白,肺泡结构破坏,急性肺损伤造模成功。3、利用透射电镜、Western blot验证成功提取血清外泌体。镜下观察到分离的外泌体,为直径约在30-100nm之间的膜性微囊结构,呈圆形或椭圆形;Western blot验证外泌体有CD63的表达,而血清提取外泌体后的上清无CD63的表达。4、ALI组小鼠的血清中有18种细胞因子表达与对照组相比有显著性差异(P<0.05),分别为IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-17、MIP-1 α、MIP-1 β、MIP-2、MCP-1、KC、IP-10、Eotaxin、RANTES、MIG、G-CSF、IL-10和LIF。有6种促炎因子于造模后呈上升趋势,IL-6、TNF-α 于 2h 达高峰,IFN-γ、IL-1α、IL-1 β、IL-17 于 8h 达高峰。IL-6、IL-1α、IL-1β 2h和8h实验组与对照组相比均有显著性差异(P<0.05)。IFN-γ(P=0.969)、IL-17(P=0.823)2h实验组与对照组相比无显著性差异。有9种趋化因子于造模后呈上升趋势,其中MIP-1 α、MIP-1 β、MIP-2、MCP-1、KC于2h达高峰,IP-10、Eotaxin、RANTES、MIG 于 8h 达高峰。MCP-1、IP-10、Eotaxin、KC 的2h和8h实验组与对照组相比均有显著性差异(P<0.05)。MIP-1α(P=0.629)、MIP-1 β(P=0.354)、MIP-2(P=0.920)的8h实验组与对照组相比无显著性差异。RANTES(P=0.434)、MIG(P=0.532)的2h实验组与对照组相比无显著性差异。有G-CSF于造模后呈上升趋势,于8h达高峰,与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。有2种抑炎因子于造模后呈上升趋势,IL-10于2h达高峰,LIF于8h达高峰,IL-10的2h和8h实验组与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。LIF(P=0.121)2h实验组与对照组相比均无显著性差异。另一方面,ALI组小鼠血清外泌体中有1 1种细胞因子表达与对照组相比有显著性差异(P<0.05),分别为 IL-6、MIP-1 β、MIP-2、MCP-1、KC、IP-10、Eotaxin、RANTES、MIG、G-CSF和LIX。只有1种促炎因子IL-6于造模后呈上升趋势,且于8h达高峰,IL-6的2h和8h实验组与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。但2h与8h相比无显著性差异(P=0.615);有9种趋化因子于造模后呈上升趋势,其中MIP-1β、MIP-2、KC 于 2h 达高峰,MCP-1、IP-10、Eotaxin、RANTES、MIG、LIX于8h达高峰,MCP-1、IP-10的2h和8h实验组与对照组相比均有显著性差异(P<0.05)。Eotaxin(P=0.138)、RANTES(P=0.575)、MIG(P=0.716)的2h实验组与对照组相比无显著性差异。MIP-1 β(P=0.141)、MIP-2(P=0.780)的8h实验组与对照组相比无显著性差异。LIX(P=0.557)、KC(P=0.051)实验组的2h与8h相比无显著性差异。G-CSF于造模后呈上升趋势,于8h达高峰,2h和8h实验组与对照组相比均有显著性差异(P<0.05)。5、利用PBS、LPS和对照组及实验组提取的血清外泌体进行体外小鼠巨噬细胞株(RAW264.7)划痕实验,急性肺损伤时血清外泌体表现出与LPS相似的作用,即趋化巨噬细胞向划痕部位迁移的作用。结论:LPS诱导的急性肺损伤,促炎及抑炎因子大多以游离形式存在于血液中,外泌体中的细胞因子表达谱则以趋化因子为主,内毒素性急性肺损伤时血清中的外泌体可呈现趋化巨噬细胞迁移的作用。