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目的1.建立兔肾间质纤维化动物模型的制作及评价方法。2.用本实验室创制的诱导剂诱导兔皮肤成纤维细胞重编程为多能性干细胞。3.观察诱导性自体干细胞移植后肾间质纤维化模型兔后在肾组织内的分布情况,并通过检测血浆肾功能指标的变化、SPECT观察肾小球滤过率和肾组织结构分析评价诱导性自体干细胞移植治疗肾间质纤维化的作用。方法1.兔肾间质纤维化模型的建立:取25只普通级日本大耳白兔,随机分为正常组(5只):不做任何处理;模型组(20只):行左侧输尿管结扎术,第8周分析血浆肌酐及尿素氮水平并随机抽取2只家兔处死做病理切片观察造模情况,提示符合模型标准后将模型组随机分为:移植组(10只),左侧输尿管结扎造成肾间质纤维化后回输诱导后自体干细胞;对照组(8只),左侧输尿管结扎造成肾间质纤维化后输注等量生理盐水处理。2.自体成纤维细胞的培养、标记和诱导:造模后第4周对移植组模型兔进行腿部去毛、消毒采集皮肤组织,经双抗浸泡后,采用酶消化法和常规培养得到贴壁生长的皮肤成纤维细胞,当原代细胞融合达80%,进行传代并且在第二代加入携带GFP基因的逆转录病毒载体(由本实验室提供),标记72小时(h)后收集部分细胞并用流式细胞仪检测其转染率,同时传代培养,当第3代的成体细胞密度达到80%细胞融合时,开始加诱导液,诱导培养72 h后收集细胞,并在倒置显微镜下观察细胞生长特性及形态特征。3.诱导性自体干细胞移植治疗肾间质纤维化模型兔的疗效评价:将GFP基因标记的诱导性自体干细胞经肾动脉植入移植组模型动物肾内,于移植后第1、4、8周(w)采集外周血分离血浆进行肾功能相关指标检测,并在移植后第8w进行肾活检,行病理组织切片,将组织切片进行脱蜡处理后置于荧光显微镜下观察移植细胞的分布情况;另对小部分肾组织行常规病理切片和HE染色,观察肾间质纤维化组织细胞移植后的组织结构变化;并于第16w采用单光子发射电子计算机断层成像仪(SPECT),扫描观察肾小球滤过率变化。4.统计分析:实验数据以均值±标准差((?)±s)的形式表示,采用SPSS15.0软件对血浆肾功能进行两个水平组间比较,采用独立样本t检验,检验值为P<0.05时具有统计学意义。结果1.模型兔肾组织病理学改变:模型组活体取才肾切片可见肾重度萎缩,肾小管广泛萎缩、数目减少、肾小管基底膜增厚、结构紊乱,肾小球囊腔扩张、囊腔内毛细血管球明显闭塞、呈缺血改变,肾间质弥漫性炎细胞浸润、重度纤维化。2.模型兔血生化指标:从造模前到造模后8w,模型组家兔外周血浆中肌酐含量由(9.30±1.27)mmol/l升高到(14.94±2.06)mmol/l;尿素氮含量由(99.60±6.73)umol/l升高到(178.00±18.19)umol/l。3.细胞形态学观察:原代家兔皮肤成纤维细胞培养0.5-1小时开始贴壁,1-2天观察细胞为梭形,形成大小不一的集落,培养3-4天能达到80%细胞融合,传代时能均匀分布,GFP标记细胞呈绿色荧光,诱导培养72h后细胞由原来的梭形变为不规则形、体积变大。4.诱导后细胞的移植和植入细胞分布的观察:将诱导后细胞经移植组家兔股动脉注入肾动脉,8w后肾间质纤维化的组织中可见绿色荧光细胞,密集分布,多聚集于肾小管、肾小球毛细血管襻和小动脉;对照组未见绿色荧光细胞分布。5.细胞移植后组织病理学观察:移植组活体取才肾切片可见肾小管中度萎缩,基底膜偏厚,小管多灶性扩张,肾小球囊腔扩张,肾间质散在炎细胞浸润、轻度纤维化改变;对照组肾重度萎缩,肾小管广泛萎缩、数目减少、肾间质弥漫性炎细胞浸润、重度纤维化。6.细胞移植后肾功能改变:细胞移植组诱导性自体干细胞移植后8周血浆Scr由(14.75±1.87)mmol/l降低到(10.06±2.12)mmol/l、Bun由(185.30±21.66)umol/l降低到(113.78±12.78)umol/l,未经细胞移植的对照组血浆Scr由(15.06±2.24)mmol/l升高到(17.66±3.20)mmol/l、Bun由(178.40±20.35)umol/l升高到(202.20±23.95)umol/l,移植组与对照组比较,在第12、16w时Scr、Bun均有显著差异(P<0.05)。7.SPECT检测结果显示移植组与对照组的肾小球率过滤(GFR)分别为67.1ml/min和47.3ml/min,两者比较有显著差异(P<0.05)。结论1.单侧输尿管结扎8w,成功建立了兔肾间质纤维化模型:SPECT检测、病理组织学观察和肾功能相关生化指标分析结果基本符合为肾间质纤维化标准。2.成功将肾间质纤维化家兔皮肤成纤维细胞标记上GFP基因,标记阳性率为92%。3.利用本实验室创制的诱导剂成功诱导兔皮肤成纤维细胞逆向分化为多能性干细胞。4.诱导性自体干细胞移植能够部分修复损伤的肾组织,抑制肾间质纤维化的发展,部分逆转肾间质纤维化进程,使其向正常结构发展并改善肾功能。