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目的:项目组前期研究表明银翘散能提高寒冷致上呼吸道黏膜免疫功能低下模型(upper airway immunity dysfunction model,UAID model)小鼠上呼吸道黏膜免疫功能,并证实银翘散对UAID model合并鼻腔接种肺炎链球菌感染小鼠有生存保护作用。本研究从SIg A的合成和分泌过程着手进一步研究银翘散防治急性上呼吸道感染(Acute upper respiratory tract infection,AURI)的作用机制。方法:1.寒冷致上呼吸道黏膜免疫功能低下模型的复制以小鼠唾液中SIgA的含量为指标评价UAID model的复制是否成功;并采用Western Blot技术、Real-Time PCR技术分别检测UAID model小鼠口腔及咽喉部黏膜组织中免疫球蛋白A(immunoglobulin A,Ig A)和多聚体免疫球蛋白受体(polymeric immunoglobulin receptor,p Ig R)的蛋白表达及p Ig R的m RNA表达水平的变化,为后期研究银翘散对上呼吸道黏膜免疫作用机制奠定基础。2.银翘散调节上呼吸道黏膜免疫作用机制的研究2.1 IgA蛋白及相关细胞因子的测定:复制UAID model后,处死小鼠,取小鼠口腔及咽喉部黏膜组织,采用Western Blot技术检测银翘散对UAID model小鼠口腔及咽喉部黏膜组织中Ig A蛋白表达的影响,并采用ELISA法检测银翘散对UAID model小鼠口腔及咽喉部黏膜组织中细胞因子IL-4、IL-6和TGF-β含量的影响;2.2 pIgR的蛋白表达及mRNA表达和相关细胞因子的测定:模型复制及取材同2.1,之后采用Western Blot技术、Real-Time PCR技术分别检测银翘散对UAID model小鼠口腔及咽喉部黏膜组织中p Ig R的蛋白表达及m RNA表达的影响,并采用ELISA法检测银翘散对UAID model小鼠口腔及咽喉部黏膜组织中细胞因子IFN-γ、TNF-α含量的影响。通过对小鼠口腔及咽喉部黏膜组织中Ig A和p Ig R的蛋白表达及p Ig R的m RNA表达水平,以及相关细胞因子含量的检测,探讨银翘散调节上呼吸道黏膜免疫作用的可能机制。3.银翘散对UAID合并病毒感染模型小鼠的保护作用研究3.1流感病毒对UAID model小鼠半数致死量(LD50)的测定:取冻存的流感病毒液,复融后用生理盐水10倍比连续稀释为10-1~10-6 6个浓度组备用。复制UAID model[1]后,采用乙醚轻度麻醉小鼠,用移液枪经小鼠鼻腔接种10-1~10-6流感病毒液,0.05 ml/只,连续观察14 d,记录小鼠的死亡数,并计算死亡率,按Reed-Meunch法[4]计算流感病毒对小鼠的半数致死量(LD50)。以LD50浓度的病毒作为药效学研究中流感病毒的感染浓度。3.2银翘散对UAID合并病毒感染模型小鼠死亡率、存活时间的影响复制UAID model,采用乙醚轻度麻醉小鼠,用移液枪经小鼠鼻腔接种引起小鼠LD50浓度的流感病毒,0.05 m L/只,记录14 d各组小鼠的死亡数、存活时间,并计算死亡率、生命延长率,以评价银翘散对UAID合并病毒感染模型小鼠的生存保护作用。3.3银翘散对UAID合并病毒感染模型小鼠肺指数的影响实验动物分组、给药剂量、复制UAID model及接种病毒的方法同3.2,于小鼠感染病毒后第6 d称小鼠体重后摘眼球放血处死动物,取全肺称重,计算肺指数及肺指数抑制率。通过对肺指数的观察,评价银翘散对UAID合并病毒感染模型小鼠肺脏的保护作用。结果:1.UAID model的复制与评价-20℃的寒冷刺激15 min能降低小鼠唾液中SIgA的含量(P<0.05),同时也能下调小鼠口腔及咽喉部黏膜组织中p Ig R的m RNA水平(P<0.05)和蛋白表达水平(P<0.05),而对Ig A的蛋白表达仅有降低趋势,差异无统计学意义(P>0.05),提示-20℃的寒冷刺激15 min可能是通过下调小鼠口腔及咽喉部黏膜组织中p Ig R的表达,致使SIg A的分泌减少,从而降低了小鼠上呼吸道黏膜免疫功能。2.银翘散调节上呼吸道黏膜免疫作用机制的研究:2.1银翘散对Ig A的蛋白表达及相关细胞因子的影响:银翘散能增加UAID model小鼠口腔及咽喉部黏膜组织中细胞因子IL-6的含量,差异有统计学意义(P<0.05);而对Ig A的蛋白表达以及IL-4、TGF-β仅有增高趋势,差异无统计学意义(P>0.05,P>0.05)。2.2银翘散对pIgR的蛋白表达及mRNA表达和相关细胞因子的影响:银翘散能上调UAID model小鼠口腔及咽喉部黏膜组织中pIgR的mRNA及蛋白表达水平,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);还能增加UAID model小鼠口腔及咽喉部黏膜组织中细胞因子IFN-γ、TNF-α的含量,差异有统计学意义(P<0.001,P<0.001)。3.银翘散对UAID合并病毒感染模型小鼠的保护作用研究:3.1流感病毒对UAID model小鼠LD50的测定:本室保存的甲型流感病毒鼠肺适应株H1N1感染小鼠的LD50值为3.33,将10-3.33浓度的流感病毒作为感染UAID model小鼠的病毒浓度做后续实验。3.2银翘散对UAID合并病毒感染模型小鼠的保护作用:银翘散能明显降低UAID合并病毒感染模型小鼠的死亡率(P<0.05),延长其生存时间(P<0.05),对UAID合并病毒感染模型小鼠的肺指数有抑制作用(P<0.05)。结论:1.寒冷可能是通过下调小鼠口腔及咽喉部黏膜组织中pIg R的mRNA水平及蛋白表达水平抑制了SIg A的分泌,从而降低了小鼠上呼吸道黏膜免疫功能。2.银翘散提高上呼吸道黏膜免疫的作用可能与其提高口腔及咽喉部黏膜组织中细胞因子INF-γ和TNF-α的含量,上调p Ig R的基因和蛋白的表达,从而增加上呼吸道SIg A的含量有关。3、银翘散对UAID合并病毒感染模型小鼠有保护作用,其作用可能与其提高UAID model小鼠口腔及咽喉部黏膜中细胞因子INF-γ和TNF-α的含量,上调p Ig R基因和蛋白的表达,从而增加了上呼吸道SIg A的含量,提高上呼吸道黏膜免疫功能有关。