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植酸(肌醇六磷酸)是植物饲料中磷的主要贮存形式。由于单胃动物(如家禽、猪等)体内缺乏分解植酸的酶,因此植酸磷难以得到有效利用。植酸酶,即肌醇六磷酸磷酸水解酶,在饲料中添加植酸酶则可提高植物性饲料中磷的利用率和单胃动物对矿质元素的吸收,并减轻动物排泄物中磷对环境的污染,这使得植酸酶作为饲料添加剂具有广泛的应用前景。植酸酶广泛存在于植物、动物和微生物中,但是天然材料中植酸酶活性很低,为了得到大量的植酸酶,人们利用基因工程技术构建植酸酶基因工程菌株实现高效表达;在分子水平上对植酸酶基因进行改造,如提高耐热性、催化活性以及对单胃动物胃肠道pH的适应性等,使其更适合作为饲料添加剂在动物体内发挥催化作用。本文以自行筛选的产胞外植酸酶的黑曲霉菌株Aspergillus niger N-J为出发菌株,克隆植酸酶phyA基因,并将其连接构建到毕赤(Pichia pastoris)酵母分泌型表达载体pPICZαA中,利用电击转化的方法将pPICZαA/phyA转入毕赤酵母中,构建植酸酶酵母工程菌株,高效表达了有良好应用性质的胞外植酸酶。本实验的主要结果如下:1.产胞外植酸酶的黑曲霉菌株的筛选将从不同地方采集的土壤样品在含有植酸钙的筛选培养基上进行筛选,能够水解植酸钙产生透明圈的菌株即为阳性菌株,微生物学鉴定为黑曲霉,命名为Aspergillus niger N-J。2.黑曲霉A. niger N-J植酸酶phyA基因的克隆利用改进的氯化苄法提取A. niger N-J基因组,并以基因组DNA为模板,通过PCR扩增出大小约为1.4 kb的植酸酶phyA基因片段。序列分析表明phyA开放阅读框长度为1347 bp,包含编码448个氨基酸的植酸酶成熟肽的完整序列;其核苷酸序列与A. niger NRRL3135 phyA基因(GenBank Accession No. Z16414)的同源性为96.44%,推导出的氨基酸序列同源性为97.77%。在phyA基因编码的氨基酸序列中,存在11个潜在的N-糖基化位点及组氨酸酸性磷酸酶的活性位点保守序列RHGARYP,位于氨基酸序列的+62~+68。3.黑曲霉A. niger N-J植酸酶phyA基因在毕赤酵母中的高效表达将pMD-T/phyA质粒经双酶切后构建植酸酶酵母表达载体pPICZαA/phyA。将重组表达载体pPICZαA/phyA质粒用Pme I线性化后电击转化毕赤酵母Pichia pastoris GS115,经抗生素Zeocin和酵母PCR筛选获得多株酵母工程菌。对5株酵母工程菌进行植酸酶的诱导表达和生物学活性测定,其中一株高表达工程菌株ZαA-phyA-2,甲醇诱导(终浓度为2%)96 h后发酵液植酸酶活力达242,000 U/mL,比出发菌株酶活力(8 U/mL)提高了30,000倍,表达植酸酶的比活力为503,000 U/mg蛋白,从而实现了植酸酶phyA基因在毕赤酵母中的高效表达。4.毕赤酵母表达植酸酶性质的研究SDS-PAGE分析表明表达植酸酶的表观分子量为66~80 kD左右。表达的植酸酶对于植酸钠和pNPP的Km值分别为0.196 mM和18.15 mM;kcat/Km分别为2.0×106 M-1s-1和104.7 M-1s-1。其最适反应pH值为5.5,在pH值为2.5~5.5的范围内能保持较高的酶活力;在pH 5.5和反应时间为10分钟的条件下,表达植酸酶的最适反应温度为55℃;90℃下加热处理15分钟仍可保持68.8%左右的酶活力,比世界范围内广泛应用的植酸酶饲料添加剂NatuphosR在相同条件下处理后剩余的酶活力高13%左右;利用荧光光谱分析表明,表达的植酸酶在90℃下热处理60 min后红移4 nm,用6 M脲处理完全变性后红移8 nm,说明表达的植酸酶具有较稳定的三级结构。