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复方中药“艾可清”是广州中医药大学热带医学研究所研究人员研创的专利配方,由黑顺片、淫羊藿、虎杖、黄柏、黄芩、甘草等10味中药组成。该方用于国家艾滋病中医药关爱项目临床试治HIV/AIDS,多年来观察到口服给药有稳定CD4计数,改善临床症状和体征、提高生活质量等效果。虽然艾可清的临床疗效良好,但其药效物质基础尚未明确。为了进一步合理开发,使其符合成分明确、质量稳定可控、机制基本清楚、安全有效等现代中药的特点,该复方的药效物质基础研究是十分必要的。目的:本研究以复方中药艾可清为研究对象,基于液质联用技术,对复方中的化学物质进行体内体外系统的定性分析,旨在明确艾可清的化学物质组成和探索可能在体内发挥药效的成分。从药物代谢酶的角度研究艾可清及其活性成分对细胞色素P450酶的影响,以阐明艾可清对联合使用的抗病毒化药的相互作用的物质基础,为临床合理用药提供指导,也为艾可清进一步的药理作用和作用机制研究提供基础。方法:1.建立UPLC-ESI-QTOF-MS方法,对对照品、艾可清提取物和各味药材提取物进行测定。通过分析总结对照品裂解规律,对艾可清中化合物分析质谱碎片、精确分子质量结合参考文献对艾可清的化学成分进行系统的定性分析和来源归属。2.采用UPLC-ESI-QTOF-MS法,测定SD大鼠连续灌胃给药艾可清后的血浆、胆汁、尿液和粪便等生物样品。通过比较对照品、艾可清提取物、含药大鼠生物样品及空白大鼠生物样品质谱数据,分析鉴定艾可清在大鼠体内的原型成分和代谢产物。3.采用体外孵育人肝微粒体法,通过人肝微粒与混合探针、待测物共孵育,LC-MS法测定代谢产物含量,计算计算IC50值,初步评价艾可清复方提取物对人肝脏药物代谢酶 CYP450 中 8 个重要亚型(CYP2D6,CYP2C8,CYP2E1,CYP2C19,CYP1A2,CYP2B6,CYP2C9 和 CYP3A4)的抑制作用。利用 Western Blot 技术,检测连续灌胃给药7天后艾可清对大鼠肝脏的CYP2D6和CYP3A4蛋白表达的影响。4.利用分子对接计算技术,采用SYBYL-X 2.1.1软件及Discovery Studio 2016软件,以药物代谢酶两个重要的亚型CYP3A4和CYP2D6蛋白为靶蛋白,对已鉴定的艾可清中123个化学成分旳抑制活性进行预测,结合体内成分分析结果和文献研究,筛选出候选化合物进一步进行体外验证实验的候选化合物。通过体外孵育人肝微粒体法测定候选化合物对CYP3A4和CYP2D6的抑制作用。5.采用HPLC-MS/MS法建立同时测定大鼠血浆中洛匹那韦和利托那韦含量的分析方法。采用乙腈沉淀蛋白法进行样品前处理,分别以氘代洛匹那韦、氘代利托那韦为内标,色谱分析采用 Agilent 的 ZORAX Eclipse Plus C18(3.5 μm,50× 4.6mm),柱温为室温,流动相为35%A(0.1%甲酸-水)-65%B(0.1%甲酸-乙腈)。质谱检测采用电喷雾离子源(ESI),正离子模式,MRM检测。本研究进行了系统的方法学评价,并运用于评价艾可清对抗HV药物克力芝在大鼠体内的药代动力学的影响。结果:1.建立了 UPLC-ESI-QTOF-MS法,共鉴定了艾可清中123个化合物,包括生物碱类33个、黄酮类57个、皂苷类12个、蒽醌类5个、丹酚酸类3个,其他13个,并对化学成分植物来源进行了归属,且系统阐明了组方中的10种药材代表性化合物群的裂解规律。2.采用建立的UPLC-ESI-QTOF-MS法对艾可清在大鼠血浆、胆汁、尿液和粪便中的原型成分及代谢物进行了分析。共分析鉴定了艾可清在大鼠体内吸收入血浆共52个原型成分和8个代谢产物;经胆汁排泄的原型成分共36个,代谢产物8个;经尿液排出的原型成分共45个;经粪便排泄的原型成分53个。3.体外孵育人肝微粒体法测定结果显示艾可清甲醇提取物在0-0.5 mg/mL浓度范围内,IC50值分别为 0.0077,0.0753,0.144,0.0995,0.0435,0.1045,0.0493,0.2049 mg/mL,表明艾可清可不同程度地抑制CYP2D6,CYP2C8,CYP2E1,CYP2C19,CYP1A2,CYP2B6,CYP2C9 和 CYP3A4,以对 CYP2D6 的抑制作用较为明显。Western blot法检测了大鼠肝脏CYP3A4和CYP2D6的蛋白表达,研究结果显示,与对照组相比,艾可清组大鼠肝脏的CYP3A4和CYP2D6的蛋白表达均显著降低。4.经分子对接计算,结合吸收入血的成分分析结果,从已鉴定的化合物中计算模拟出18个可能的活性化合物。18个化合物体外孵育人肝微粒体法测定,结果显示艾可清中的成分甘草次酸(IC50=3.36 μM)、丹酚酸A(IC50=6.05 μM)、宝蕾苷Ⅰ(IC50=9.470 μM)、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ(IC50=13.50 μM)对CYP3A4存在不同程度的抑制作用;丹酚酸A对于CYP2D6存在中等强度的抑制作用(IC50=8.49μM),小檗碱对CYP2D6存在弱抑制作用(IC50=13.45 μM)。5.经方法学验证,本文建立的HPLC-MS/MS法准确、灵敏、简便、快速。洛匹那韦和利托那韦分别在30-10000 ng/mL和3-1000 ng/mL范围内的有较好的线性关系,最低定量限分别为30 ng/mL和3 ng/mL;日内、日间精密度均小于15%,洛匹那韦和利托那韦的准确度分别介于95.3%～107%和96.7%～104%之间;提取回收率均大于88.7%;基质效应基本可以忽略;经考察血浆样品室温放置6h、血浆样品提取后进样器放置72 h、血浆样品-80℃经历3次冷冻-解冻循环、-80℃放置37天的稳定性,两个检测成分稳定性较好。该定量分析方法应用于评价艾可清对抗HIV药物克力芝在大鼠体内的药代动力学的影响。结果显示,艾可清与克力芝联合用药组的洛匹那韦非房室模型参数 AUC(0-t)、AUC(0-∞)、MRT(0-t)、t1/2z、Tmax、Vz/F、CLz/F、Cmax与单用克力芝对照组比较,差异均无统计学意义,MRT(0-∞)与单用克力芝对照组比较,差异有统计学意义;而艾可清与克力芝联合用药组的利托那韦非房室模型参数 AUC(0-t)、AUC(0-∞)、MRT(0-t)、MRT(0-∞)、t1/2z、Tmax、Vz/F、CLz/F、Cmax与单用克力芝对照组比较,差异均无统计学意义。结果表明,艾可清与克力芝联合用药时,在大鼠体内对其组成成分洛匹那韦和利托那韦的药代动力学参数无明显的影响。结论:本论文首次对复方中药艾可清中化学成分进行系统分析识别,艾可清成分在体内的代谢变化过程分析,为提高艾可清的质量控制水平提供了化学成分组成的基础。体内体外药理实验提示艾可清对CYP3A4和CYP2D6有抑制作用,临床上联合HARRT药物使用,有可能通过抑制CYP3A4、CYP2D6的活性,影响药物的代谢特征。艾可清中的成分甘草次酸、丹酚酸A、宝藿苷Ⅰ、鼠李糖基淫羊蕓次苷Ⅱ、以及小檗碱等成分对艾可清复方整体的CYP3A4和CYP2D6抑制作用有贡献。当艾可清与抗HIV药物克力芝联合用药时,对后者在大鼠体内的药动学参数无显著影响。