慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)是一种严重危害人们身体健康的常见疾病。慢阻肺发病与多种因素有关，吸烟是导致慢阻肺的最主要原因，我国广州地区慢阻肺人群中90％与吸烟有关，吸烟者慢阻肺的患病率较非吸烟者高4倍。烟草中含有许多有害成分，尼古丁是烟草的主要成分之一。业已证明，尼古丁可以通过兴奋神经肌肉系统中的烟碱样受体（nAchRs）而发挥作用。过去认为nAchRs主要在神经系统中起作用，但是，最近的一些研究证实，nAchRs还在非神经系统的细胞和组织（如角蛋白细胞，癌细胞，免疫细胞、血管内皮细胞、膀胱、生殖器官等）中表达和起作用；尼古丁可以直接作用于人支气管上皮细胞，影响气道上皮的生长和凋亡；并可直接作用于nAchRs，上调细胞周期素蛋白D1(CyclinD1)诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞的增殖。在牛肺组织内和正常BALB/c小鼠气道平滑肌上含有nAchRs亚单位。我们前期预实验发现尼古丁可以直接引起气道平滑肌细胞增殖。此现象可能会导致平滑肌层增厚，提示尼古丁可能与吸烟引起的气道重塑有关。　　我们推测，尼古丁可能通过直接作用于气道平滑肌细胞上的特异nAchRs促进平滑肌细胞的增殖特性发生变化，导致气道平滑肌细胞的增殖和气道结构的重塑。本实验即拟通过观察气道平滑肌细胞上尼古丁特异nAchRs的表达水平、尼古丁所致气道平滑肌细胞的特性变化与机制等，探讨尼古丁在慢性阻塞性肺疾病发病中的可能作用，阐述慢阻肺的发病机制。　　第一部分尼古丁对大鼠气道平滑肌细胞增殖的影响　　目的：　　了解大鼠气道平滑肌细胞是否有尼古丁受体表达；尼古丁暴露是否能够引起细胞增殖以及尼古丁暴露的剂量-时间依赖性；利用尼古丁受体拮抗剂实验分析尼古丁促增殖作用是否由尼古丁受体介导。　　方法：　　1、大鼠气道平滑肌细胞尼古丁受体的表达研究。（1）气道平滑肌细胞的原代培养及鉴定：清洁级4-8W SD雄性大鼠，分离取出气管，采用改良的酶消化法和组织贴块法培养原代气道平滑肌细胞，细胞通过形态学观察并经α肌动蛋白(α-actin)免疫荧光和激光共聚焦鉴定。（2）观察 nAchRs在大鼠气道平滑肌细胞上的表达：分别设计相应的RNA引物，应用RT-PCR实验，观察大鼠气道平滑肌细胞上存在的nAchRs亚单位情况。　　2、尼古丁对大鼠气道平滑肌细胞增殖的影响。以不同浓度尼古丁（1x10-7mol/l、1x10-6mol/l、1x10-5mol/l、1x10-4mol/l)处理原代大鼠气道平滑肌细胞，分别于不同刺激时间点收集细胞。（1）应用细胞计数仪检测刺激24h与48h的细胞数量。（2）以流式细胞术检测刺激24h后的细胞G1、G2及S期细胞分数的变化。（3）以胸腺嘧啶核苷类似物EDU摻入法测定尼古丁刺激12h、15h、18h、21h和24h时细胞复制情况；（4）以Western blot法检测尼古丁处理细胞12h、16h、20h和24h后的细胞周期素蛋白D1（CyclinD1）与视网膜母细胞瘤蛋白（RB）/磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（P-RB）的水平。　　3、尼古丁受体在尼古丁刺激大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用。实验分成6组：对照组、尼古丁组、非竞争性尼古丁受体拮抗剂MCA组、非竞争性尼古丁受体拮抗剂MCA+尼古丁组、α7尼古丁受体特异性拮抗剂MG624组、α7尼古丁受体特异性拮抗剂MG624+尼古丁组。尼古丁作用浓度为1x10-5mol/l。(1)处理细胞24h,各组收集细胞，细胞计数仪检测刺激24h后细胞的数量；(2)处理细胞24h，EDU摻入法检测细胞复制的情况；(3)处理细胞12h或24h后,以Western blot检测CyclinD1与磷酸化RB的水平。　　结果：　　1、大鼠气道平滑肌细胞上存在nAchRs亚单位。　　（1）成功培养出大鼠原代气道平滑肌细胞。通过形态学观察，并经α肌动蛋白(α-actin)免疫荧光和激光共聚焦鉴定，确认细胞为平滑肌细胞，纯度达99%。　　（2）大鼠气道平滑肌细胞上存在尼古丁受体亚单位,分别是α1,4,7,9,10,β1,2,4。　　2、尼古丁能够促进大鼠气道平滑肌细胞的增殖。　　（1）尼古丁刺激组细胞计数均明显高于对照组,且尼古丁的促增殖作用与浓度和作用时间具有相关性。1x10-7mol/l-1x10-4mol/l尼古丁暴露24h，以对照组细胞计数值为1，细胞计数增加倍数分别为1.30,1.27,1.41,1.38,均差异显著，P<0.05；尼古丁暴露48h，细胞计数增加倍数分别为1.37,1.32,1.54,1.53,均差异显著，P<0.05。　　（2）以流式细胞术检测细胞周期G1、G2及S期细胞分数，各浓度尼古丁组均促进细胞周期S期的细胞分数，与对照组相比明显升高，具有统计学意义。以对照组细胞周期 S期的细胞分数值为1，1x10-7mol/l-1x10-4mol/l尼古丁暴露24h， S期的细胞分数增加倍数分别为1.53,2.35,3.83,2.86,均差异显著， P<0.05。　　（3）以胸腺嘧啶核苷类似物EDU摻入法检测细胞复制能力，尼古丁刺激后， EDU值较对照组明显升高。以对照组EDU值为1，1x10-5mol/l尼古丁暴露12h，15h,18h,21h,24h后与对照组相比，EDU值增加倍数分别为1.60,1.16,1.22,1.28,1.91,均差异显著，P<0.05。　　（4）1x10-5mol/l尼古丁作用细胞12h、16h、20h、24h后，在12h时间点，细胞CyclinD1水平明显高于对照组；在24h时间点，磷酸化RB蛋白水平明显高于对照组，差异均具有统计学意义，P<0.05。　　3、尼古丁通过尼古丁受体发挥作用。　　（1）尼古丁刺激能使细胞计数、细胞复制水平（EDU）、CyclinD1及磷酸化RB蛋白水平均明显增高，与对照组相比，有明显的统计学意义，P<0.01。未经尼古丁处理细胞以尼古丁受体拮抗剂MCA和MG624单独作用时，细胞的增殖以及相应的增殖指标如细胞计数、细胞复制水平（EDU）、CyclinD1和磷酸化RB无显著变化。　　（2）MCA+尼古丁作用于细胞后，细胞计数、细胞复制水平（EDU）、CyclinD1和磷酸化RB水平均明显低于尼古丁单独刺激组，与非尼古丁处理对照组无显著差异：24h对照组、24h尼古丁处理组、以及24hMCA+尼古丁组细胞计数比值分别为1，1.21,0.92；细胞复制水平（EDU）比值分别为1,1.40,1.04。12h MCA+尼古丁组CyclinD1，24h MCA+尼古丁组磷酸化RB水平与尼古丁单独刺激组相比明显下降，P均<0.05，与对照组相比无明显差异，P均>0.05。　　（3）MG624+尼古丁作用于细胞后，细胞计数、细胞复制水平（EDU）、CyclinD1和磷酸化RB水平均明显低于尼古丁单独刺激组，与非尼古丁处理对照组无显著差异（P均>0.05）：24h对照组、24h尼古丁处理组、以及24hMG624+尼古丁组细胞计数比值分别为1，1.57,1.11；细胞复制水平（EDU）比值分别为1,1.40,1.04；12h MG624+尼古丁组CyclinD1水平与对照组相比无明显差异（P>0.05）。　　第二部分AKT/GSK3β信号传导途径在尼古丁促进大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用研究　　目的：　　了解 AKT/GSK3β信号途径是否与尼古丁的细胞增殖效应有关；尼古丁对AKT/GSK3β信号途径的激活是否由尼古丁受体介导；AKT/GSK3β特异性阻断是否能够抑制尼古丁引起的细胞增殖效应。　　方法：　　1、尼古丁对大鼠气道平滑肌细胞表达磷酸化 AKT和磷酸化 GSK3β的影响。（1）以不同浓度尼古丁（1x10-7mol/l、1x10-6mol/l、1x10-5mol/l、1x10-4mol/l)处理原代大鼠气道平滑肌细胞，刺激30min后,以Western blot检测磷酸化AKT（P-AKT），磷酸化GSK3β（P-GSK3β）的表达水平；（2）以1x10-5mol/l尼古丁刺激细胞不同时间（0、5min、15min、30min、60min），用Western blot检测细胞磷酸化 AKT（P-AKT）,磷酸化 GSK3β（P-GSK3β）的表达水平；（3）以1x10-5mol/l尼古丁及尼古丁＋尼古丁受体拮抗剂MCA或者MG624、以及MCA或者MG624单独处理细胞30min，以Western blot检测被刺激细胞磷酸化AKT和磷酸化GSK3β的水平。　　2、AKT/GSK3β信号通路在尼古丁刺激细胞增殖中的作用。实验分为6组：对照组、尼古丁组、AKT抑制剂LY294002组、AKT抑制剂LY294002+尼古丁组、GSK3β抑制剂SB216763组、GSK3β抑制剂SB216763组+尼古丁组。尼古丁作用浓度为1x10-5mol/l。（1）细胞被刺激24h后,应用细胞计数仪检测细胞数量；以EDU摻入法测定各组大鼠气道平滑肌细胞复制的情况。(2)各种因素刺激细胞30min、12h及24h后，以Western blot检测磷酸化AKT，磷酸化GSK3β,CyclinD1,磷酸化RB的水平。　　结果：　　1、尼古丁通过作用于大鼠气道平滑肌细胞上特异受体而促进 AKT和 GSK3β的磷酸化。　　（1）大鼠气道平滑肌细胞上有AKT和GSK3β的表达，尼古丁能够促进AKT磷酸化和GSK3β磷酸化，且具有浓度和时间依赖性，与对照组相比，差异显著,P均<0.05。　　（2）尼古丁受体拮抗剂MCA和MG624对非尼古丁处理组细胞AKT和GSK3β的磷酸化水平无影响，但是，它们能够抑制尼古丁刺激 AKT和 GSK3β磷酸化的作用，尼古丁＋MCA或者MG624组AKT磷酸化、GSK3β磷酸化水平明显低于尼古丁单独作用组（P<0.01），其中以MG624+尼古丁组的作用更为显著(P<0.001)。　　2、尼古丁促进大鼠气道平滑肌细胞的增殖作用依赖AKT/GSK3β信号途径。　　（1）GSK3β抑制剂SB216763组+尼古丁组与尼古丁单独作用组细胞计数均明显升高，与对照组相比差异显著，P均<0.05，且GSK3β抑制剂SB216763组+尼古丁组细胞计数较之尼古丁单独作用组明显升高：24h对照组、24h尼古丁组、24hSB216763+尼古丁组细胞计数比值分别为1,1.33,1.45，P均<0.05。　　（2）AKT抑制剂LY294002+尼古丁组细胞计数明显低于尼古丁单独作用组，差异显著：以24h对照组细胞计数值为1，24h尼古丁单独作用组、24h AKT抑制剂LY294002+尼古丁组细胞计数比值分别为1.3，1.01，P均<0.05。　　（3）GSK3β抑制剂 SB216763+尼古丁组及尼古丁单独作用组细胞复制水平（EDU）均明显高于对照组, GSK3β抑制剂SB216763组+尼古丁组细胞复制水平（EDU）与尼古丁单独作用组相比明显升高：24h对照组、24h尼古丁处理、以及24h GSK3β抑制剂 SB216763组+尼古丁组细胞复制水平（ EDU）比值分别1,1.55,1.76，P均<0.05。　　（4）AKT抑制剂LY294002+尼古丁组细胞复制水平（EDU）明显下降，与尼古丁单独作用组相比，差异显著：以24h对照组细胞计数值为1,24h尼古丁单独作用组，24h AKT抑制剂LY294002+尼古丁组细胞复制水平（EDU）比值分别为1.55，1.21，P均<0.05。　　（5）尼古丁单独作用组AKT磷酸化、GSK3β磷酸化、CyclinD1、RB磷酸化水平明显高于对照组，P均<0.05。AKT抑制剂LY294002+尼古丁组明显抑制AKT磷酸化，GSK3β磷酸化、CyclinD1、RB磷酸化水平与尼古丁单独作用组相比差异显著， P均<0.05。GSK3β抑制剂 SB216763组+尼古丁组GSK3β磷酸化、CyclinD1、RB磷酸化水平明显高于尼古丁单独作用组，P均<0.05。　　结论：　　1、大鼠气道平滑肌细胞上存在nAchRs亚单位；2、尼古丁能够促进大鼠气道平滑肌细胞的增殖，这种作用经过nAchRs介导；3、尼古丁能够激活AKT/GSK3β信号传导途径，促进CyclinD1表达水平的提高和RB磷酸化,最终引起大鼠气道平滑肌细胞的增殖。