[研究背景]深低温常用于需要停止全身循环的手术,如心血管外科的主动脉手术、复杂的先天性心脏病手术等和神经外科的颅内巨大动脉瘤和复杂脑血管畸形手术等,被称为深低温停循环(Deep hypothermic circulatory arrest,DHCA)技术,它的应用至今已有60多年的历史。通过降低体温到15-20℃,同时暂停循环以提供手术区“无血”的手术视野,深低温可以有效地保护脑组织避免缺血性损伤。DHCA在40-60 min内是相对安全的时限,大于这个时间,术后脑缺血性卒中和认知功能障碍的概率增加。虽然深低温对停循环后脑缺血的保护作用已经被一些动物实验和临床实践证实,但其保护机制尚未完全明了,也一直是国内外关注的焦点。自噬是一种“自我吞噬”现象,存在于真核细胞内,是细胞内的双层膜结构通过与溶酶体结合清除自身细胞器和蛋白质的过程,以实现细胞稳态和细胞器更新,某些情况下,自噬抑制凋亡,是细胞的存活途径,但有时自噬也能引起细胞死亡。自噬广泛参与各种生理和病理过程,是目前生物医学领域研究的热点。近年来研究发现,自噬、凋亡和炎症在神经系统疾病中发挥重要作用,包括脑缺血再灌注损伤、脑创伤、神经退行性病变等。DHCA中深低温对神经细胞自噬的影响如何,若有影响,深低温调节的自噬对神经细胞起什么作用,尚未有研究报道。PC12细胞是研究脑缺血和其他神经系统疾病的理想体外模型,而且体外培养的细胞成分单一不受其他细胞影响、易于控制环境因素、重复性好,是生命科学研究的基础,因此本课题使用体外模型探讨深低温对氧糖剥夺PC12细胞的作用和自噬的影响,并进一步研究深低温调节的自噬对氧糖剥夺PC12细胞炎症的作用及其机制和深低温调节的自噬对氧糖剥夺PC12细胞凋亡的作用及其机制,从这三个方面深入探讨深低温的神经保护作用和机制,为深低温神经保护提供新的理论基础,也为深低温的脑保护作用提供新的靶点和思路。第一部分深低温对氧糖剥夺PC12细胞的作用和自噬的影响[目的]建立氧糖剥夺的PC12细胞模型,研究深低温对氧糖剥夺PC12细胞的作用和作用机制,观察深低温对自噬的影响,并分析自噬在深低温氧糖剥夺细胞模型中的作用。[方法]PC12细胞培养于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的高糖DMEM培养基中,置37℃饱和湿度含5%CO2和95%空气的恒温箱中培养,胰蛋白酶消化传代,取对数生长期的细胞进行实验。建立氧糖剥夺细胞模型:弃去培养基,培养板内细胞用PBS洗涤3次,换成无糖DMEM,将培养板置于三气培养箱,通以94%N2-5%CO2-l%O2气体,37℃处理60min。按实验需求分为6组,正常对照组:常温、常氧和完全培养基中培养;单纯深低温组:18℃下常氧和完全培养基中培养60min后,缓慢复温,常温、常氧培养;单纯3-甲基腺嘌呤(3-MA)组:加入自噬抑制剂3-MA使终浓度为5 mmol/L,常温、常氧和完全培养基中培养;氧糖剥夺组:94%N2-5%C02-1%02的常温环境和无糖DMEM条件下处理60 min,常温、常氧和完全培养基中培养24 h;深低温+氧糖剥夺组:94%N2-5%CO2-1%O2的18℃环境和无糖DMEM条件下处理60min,缓慢复温后常温、常氧和完全培养基中培养24 h;深低温+氧糖剥夺+3-MA组:加入3-MA使终浓度为5mmol/L并提前60 min预处理,然后94%N2-5%C02-1%02的18℃环境和无糖DMEM条件下处理60 min,缓慢复温后常温、常氧和完全培养基中培养24h。1.倒置显微镜观察每组细胞形态学变化。2.通过CCK-8检测各组细胞存活率。3.Hoechst33258核染色荧光显微镜观察凋亡细胞的数量。4.Annexin V-FITC和PI进行细胞双染,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率。5.活性氧荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测,流式细胞仪观察细胞内活性氧(ROS)水平。6.钙离子荧光探针Fluo-3AM进行钙离子(Ca2+)检测,流式细胞仪观察细胞内钙离子水平。7.pmCherry-C1-EGFP-LC3B双荧光指示的质粒进行扩增、提取,瞬时转染细胞,荧光显微镜下观察自噬体和自噬溶酶体数目,并分析自噬流。8.电镜是检测自噬的金标准,因此采用透射电镜观察自噬体、自噬溶酶体和细胞超微结构。数据应用SPSS19.0软件进行统计分析,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用q检验。[结果]1.形态学观察显示:正常对照组、单纯深低温组和单纯3-甲基腺嘌呤(3-MA)组,PC12细胞密度高、呈梭形、体积大、树突和轴突长、连接紧密;氧糖剥夺组,细胞密度低,细胞间隙增大,树突和轴突回缩,细胞皱缩变圆,体积变小,表现出受损特征;深低温+氧糖剥夺组,细胞呈梭形,树突和轴突部分回缩,损伤减轻;深低温+氧糖剥夺+3-MA组,细胞密度比深低温+氧糖剥夺组低,树突和轴突回缩,细胞形态不规则,损伤无明显减轻。2.CCK-8法存活率检测结果显示:正常对照组、单纯深低温组和单纯3-甲基腺嘌呤(3-MA)组细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05);氧糖剥夺组与对照组相比存活率明显降低(P<0.05);深低温+氧糖剥夺组与氧糖剥夺组及深低温+氧糖剥夺+3-MA组相比存活率明显升高(P<0.05)。3.Hoechst33258荧光染色显示:正常对照组、单纯深低温组和单纯3-甲基腺嘌呤(3-MA)组凋亡细胞数较少,差异无统计学意义(P>0.05);氧糖剥夺组出现明显的凋亡特征,表现为核浓缩核碎裂,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);深低温+氧糖剥夺组与氧糖剥夺组及深低温+氧糖剥夺+3-MA组相比凋亡细胞数目明显减少(P<0.05)。.4.Annexin V-FITC/PI染流式细胞仪检测结果显示:正常对照组、单纯深低温组和单纯3-甲基腺嘌呤(3-MA)组凋亡率差异无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,氧糖剥夺组凋亡率明显增高(P<0.05);与氧糖剥夺组及深低温+氧糖剥夺+3-MA组相比,深低温+氧糖剥夺组凋亡率明显降低(P<0.05)。5.流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)水平结果显示:正常对照组、单纯深低温组和单纯3-甲基腺嘌呤(3-MA)组细胞内活性氧水平差异无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,氧糖剥夺组活性氧水平明显增高(P<0.05);与氧糖剥夺组及深低温+氧糖剥夺+3-MA组相比,深低温+氧糖剥夺组活性氧水平明显降低(P<0.05)。6.流式细胞仪检测细胞内钙离子水平结果显示:正常对照组、单纯深低温组和单纯3-甲基腺嘌呤(3-MA)组细胞内钙离子水平差异无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,氧糖剥夺组钙离子水平明显增高(P<0.05);与氧糖剥夺组及深低温+氧糖剥夺+3-MA组相比,深低温+氧糖剥夺组钙离子水平明显降低(P<0.05)。7.荧光显微镜下,双荧光指示质粒转染分组处理后结果显示:正常对照组、单纯深低温组和单纯3-MA组的自噬体和自噬溶酶体数目差异无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,氧糖剥夺组的自噬体和自噬溶酶体数目增多(P<0.05),自噬流增加,说明氧糖剥夺能激活PC12细胞的自噬;与氧糖剥夺组相比,深低温+氧糖剥夺组的自噬体和自噬溶酶体数目增多(P<0.05),自噬流增加,说明深低温能进一步增加氧糖剥夺PC12细胞自噬水平;与深低温+氧糖剥夺组相比,深低温+氧糖剥夺+3-MA组的自噬体和自噬溶酶体数目明显下降(P<0.05),说明3-MA能有效抑制自噬。8.透射电镜观察细胞超微结构显示:正常对照组、单纯深低温组和单纯3-甲基腺嘌呤(3-MA)组细胞核、线粒体和粗面内质网形态正常,正常对照组和单纯3-甲基腺嘌呤(3-MA)组几乎看不到自噬体,在单纯深低温组偶尔能发现少数自噬体,三组差异无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,氧糖剥夺组自噬体和自噬溶酶体数目增多(P<0.05)并出现细胞皱缩、核染色质边集和浓缩;与氧糖剥夺组相比,深低温+氧糖剥夺组自噬体和自噬溶酶体数目进一步增多(P<0.05),细胞超微结构形态基本正常;与深低温+氧糖剥夺组相比,深低温+氧糖剥夺+3-MA组自噬体和自噬溶酶体数目明显下降(P<0.05),并出现核染色质浓缩和线粒体空泡化现象。[结论]深低温(18℃)可以有效地抑制凋亡保护氧糖剥夺PC12细胞的损伤,并且能降低氧糖剥夺PC12细胞内活性氧(ROS)和钙离子(Ca2+)水平。氧糖剥夺损伤能激活PC12细胞的自噬,深低温进一步升高了氧糖剥夺PC12细胞的自噬水平。当通过3-甲基腺嘌呤(3-MA)阻滞自噬时,深低温抑制氧糖剥夺PC12细胞凋亡的作用减弱,提示自噬的激活在深低温保护氧糖剥夺PC12细胞损伤中起重要作用,并且深低温抗氧糖剥夺损伤的机制可能与其适度增加细胞自噬水平有关。第二部分深低温调节的自噬对氧糖剥夺PC12细胞TLR4介导的炎症信号通路的作用机制研究[目的]研究深低温调节的自噬对氧糖剥夺PC12细胞TLR4介导的炎症信号通路的作用,检测自噬标志蛋白和TLR4介导的炎症信号通路关键节点蛋白表达的变化,包括微管相关蛋白1轻链3(LC3)和Beclinl、Toll样受体4(TLR4)、核转录因子(NF-κB)、髓样分化因子88(MyD88)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α),探讨深低温神经保护的可能机制。[方法]实验分为6组:正常对照组、单纯深低温组、单纯3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、氧糖剥夺组、深低温+氧糖剥夺组和深低温+氧糖剥夺+3-MA组。选择自噬的标志性蛋白LC3和Beclinl,还有TLR4介导的炎症信号通路中关键的节点蛋白 TLR4、NF-κB、MyD88、IL-1β、IL-6 和 TNF-α,用 western blotting 检测 LC3、Beclinl、TLR4、NF-κB 和 MyD88 蛋白表达的变化,用 ELISA 测定 IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表达的变化。[结果]Western blotting检测自噬相关蛋白结果显示:正常对照组、单纯深低温组、单纯3-甲基腺嘌呤(3-MA)组相比LC3II/LC3I比值和Beclinl的蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,氧糖剥夺组LC3II/LC3I比值和Beclinl蛋白表达水平增高(P<0.05);与氧糖剥夺组及深低温+氧糖剥夺+3-MA组相比,深低温+氧糖剥夺组LC3II/LC3I比值和Beclinl蛋白表达水平明显增高(P<0.05)。Western blotting和ELISA检测TLR4信号通路相关蛋白结果显示:正常对照组、单纯深低温组、单纯3-甲基腺嘌呤(3-MA)组相比TLR4、NF-κB、MyD88、IL-lβ、IL-6和TNF-α蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,氧糖剥夺组TLR4、NF-κB、MyD88、IL-lβ、IL-6和TNF-α蛋白表达水平增高(P<0.05);与氧糖剥夺组及深低温+氧糖剥夺+3-MA组相比,深低温+氧糖剥夺组TLR4、NF-κB、MyD88、IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。[结论]深低温的保护作用与抑制TLR4信号通路有关。深低温保护氧糖剥夺PC12细胞的具体机制可能是通过深低温适度升高的自噬下调TLR4介导的炎症信号通路。第三部分深低温调节的自噬对氧氧糖剥夺PC12细胞线粒体介导的细胞凋亡信号通路的作用机制研究[目的I研究深低温调节的自噬对氧糖剥夺PC12细胞线粒体介导的细胞凋亡信号通路的作用,检测线粒体介导的细胞凋亡信号通路关键节点蛋白表达的变化,包括 Bcl-2、Bax、细胞色素 c(Cytochrome c)、Caspase-3、Caspase-9 和裂解的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(cleaved PARP-1),探讨深低温神经保护的可能机制。[方法]实验分为6组:正常对照组、单纯深低温组、单纯3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、氧糖剥夺组、深低温+氧糖剥夺组和深低温+氧糖剥夺+3-MA组。选择线粒体介导的细胞凋亡信号通路中关键的节点蛋白Bcl-2、Bax、Cytochrome c、Caspase-3、Caspase-9 和 cleaved PARP-1,用 western blotting 检测这些蛋白表达的变化。[结果]Western blotting检测线粒体凋亡信号通路相关蛋白结果显示:正常对照组、单纯深低温组、单纯3-甲基腺嘌呤(3-MA)组相比Bcl-2、Bax、Cytochrome c、Caspase-3、Caspase-9和cleaved PARP-1蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,氧糖剥夺组 Bax、Cytochrome c、Caspase3、Caspase9和cleavedPARP-1蛋白表达水平增高,Bcl-2降低(P<0.05);与氧糖剥夺组及深低温+氧糖剥夺+3-MA组相比,深低温+氧糖剥夺组Bax、Cytochrome c、Caspase3、Caspase9和cleaved PARP-1蛋白表达水平明显降低,Bcl-2明显增高(P<0.05)。[结论]深低温的保护作用与抑制线粒体凋亡信号通路有关。深低温适度升高的自噬下调线粒体介导的细胞凋亡信号通路,可能是保护神经细胞缺血缺氧损伤的机制之一。