蛋白酶体是一类多催化位点蛋白酶复合物，负责细胞内大部分蛋白质的降解，受着多种复杂因素的调控，通过有目的的降解受损伤的或者错误折叠的蛋白质进而调节整个细胞的生命过程，使整个生命过程得以高效准确地完成，这些过程包括细胞周期、细胞凋亡、DNA修复、信号转导和免疫应答等[1]。研究显示，蛋白酶体是一个多亚基蛋白水解复合物，在生物体内最普遍的蛋白酶体形式为26S蛋白酶体，由20S核心颗粒与具有激活核心颗粒作用的蛋白酶体激活因子组成[2]。在蛋白酶体激活因子作用下，蛋白质底物进入20S核心颗粒的中心水解部位被降解。目前，在生物体内主要发现了两大类重要的蛋白酶体激活因子，一类蛋白酶体激活因子是19S，又称PA700。另一类是PA28（proteasomeactivator28）蛋白酶体激活因子家族，又称11S或REG。11S是由包括PA28α、PA28β和PA28γ三个成员组成[3]。在电镜下，PA28α是一个环状颗粒，无ATP存在时即可与20S结合，形成PA28α-20S复合物，可以增大20S核心颗粒与多种底物肽的结合能力，提高生物体降解蛋白质的最大反应速度[4]。食管癌是我国北方的恶性肿瘤之一[5]。由于它在早期很难诊断，并且带有很强的转移能力，即使能够诊断出来，一般也已处于晚期。并且，食管癌的预后情况差，容易复发，确诊后的病人5年生存率仅占5~10%[6]。目前治疗食管癌的情况并不乐观，这种不乐观的情况促使了我们进一步了解食管鳞癌的发生发展机制，为降低食管鳞癌的发生率和研发新的治疗食管癌的药物提供实验依据。目前，大量研究发现多种人类恶性肿瘤中存在PA28异常表达现象。张林等[7]发现了PA28α基因能够抑制胃癌细胞的生长、增殖，同时还能够影响其细胞周期，对抑制胃癌细胞的恶性表现有一定的意义。Lemaire等[8]采用蛋白质组学方法检测到PA28α在正常卵巢上皮中定位和在癌细胞中定位不同，分别定位在细胞核、细胞质，因此PA28α可以作为卵巢癌的潜在生物学标记。研究显示，蛋白酶体的其他亚基可以作为肿瘤治疗的靶点。有研究表明在乳腺癌中PA28γ有显著的上调现象，并且增强了癌细胞的迁移能力，被作为检测乳腺癌的一个潜在的生理指标[9]。本课题以蛋白酶体激活因子PA28α为研究对象，分别从转录水平和蛋白水平检测了它在正常食管上皮细胞Het-1A和食管鳞癌细胞株Eca109、EC9706中的表达以及定位，并且进一步研究了PA28α对食管鳞癌细胞Eca109增殖、凋亡以及迁移能力的影响，为研究PA28α在细胞内的生物学功能提供了实验依据。本课题主要分为两个部分：第一部分：从转录水平和蛋白水平检测PA28α在正常食管上皮细胞Het-1A和食管鳞癌细胞株Eca109、EC9706中的表达，分析它们的表达差异，并且观察PA28α蛋白在三株细胞中的定位情况。第二部分：研究PA28α在食管鳞癌细胞发生发展中的作用。首先根据PA28α在三株细胞中的表达差异，设计沉默PA28α表达的干扰片段，并对有效干扰片段进行筛选。在IFN-γ为阳性对照的情况下，用有效的干扰片段干扰PA28α的表达，观察PA28α的表达情况，并检测PA28α的沉默表达对食管鳞癌细胞Eca109增殖、凋亡和迁移能力的影响。材料和方法1.细胞株正常食管上皮细胞Het-1A，食管鳞癌细胞EC9706、Eca109均为本实验室保存。三株细胞均在含有10%胎牛血清的RPMI-1640细胞培养基中于37℃，含5%CO2的饱和湿度的细胞培养箱中培养。2. PA28α在正常食管上皮细胞(Het-1A)与食管鳞癌细胞株(Eca109、EC9706)中表达以其定位利用实时荧光定量PCR和Western Blot分别从转录水平和蛋白水平检测PA28α在Eca109、EC9706和Het-1A三株细胞中的表达，并分析它们的表达差异。细胞免疫荧光法检测PA28α蛋白在Eca109、EC9706和Het-1A三株细胞中的定位。3. siRNA介导的PA28α基因沉默对食管鳞癌细胞Eca109增殖、凋亡和迁移能力的影响首先利用荧光显微观察筛选出最有效的干扰片段，确定最佳干扰浓度，随后通过细胞转染的方法，沉默PA28α蛋白在食管鳞癌细胞Eca109中的表达。以转染后24h的食管鳞癌细胞Eca109为研究对象，以IFN-γ为阳性对照，分别用EdU法和CCK-8法检测细胞增殖变化情况，用AnnexinV-FITC/PI双染法和Western Blot检测caspase-3凋亡因子来检测细胞凋亡的变化，用Transwell小室实验和Western Blot检测对粘附因子E-cadherin的方法检测细胞迁移的变化。结果1. PA28α在正常食管上皮细胞(Het-1A)与食管鳞癌细胞株(Eca109、 EC9706)中表达以其定位实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测结果表明：与正常食管上皮细胞Het-1A相比较，PA28α在食管鳞癌细胞Eca109和EC9706中表达量明显增加，尤其是在Eca109细胞中，结果与本实验先前消减杂交结果一致。细胞免疫荧光检测显示：PA28α蛋白主要定位于食管鳞癌细胞的细胞质。2. siRNA介导的PA28α基因沉默对食管鳞癌Eca109细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响与对照组相比，siRNA介导的PA28α的沉默能够抑制Eca109的增殖能力，并且能够促进其凋亡能力，可能是由于PA28α通过影响蛋白酶体的活性从而改变了Eca109增殖和凋亡能力，表明蛋白酶体在食管鳞癌中起着一定得作用。并且，PA28α的沉默能够抑制Eca109细胞的迁移能力和粘附因子E-cadherin的表达。结论1.与正常食管上皮细胞相比，PA28α在食管鳞癌细胞Eca109和EC9706中有高表达现象，并且在Eca109尤为明显，这可能与食管鳞癌细胞Eca109和EC9706的分化程度不同有关。2. PA28α主要定位在食管鳞癌细胞的细胞质部分。3. siRNA介导的PA28α沉默能够在一定程度上抑制Eca109的增殖能力，并且能够增强其凋亡能力，能够在一定程度上抑制Eca109细胞的迁移能力和粘附因子E-cadherin的表达。