结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)是导致肺结核形成的主要致病菌,并且是感染性疾病中致死率最高的病原菌。由于目前对于Mtb本身基础生物学研究的匮乏,使得新的药物和新的疫苗研究进展缓慢。众所周知,信号转导在原核生物以及真核生物中扮演了重要角色,Mtb也不例外。Mtb体内含有11种类真核生物丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Serine/threonine protein kinase,STPK),并且这些激酶在Mtb体内调控重要的细胞代谢过程,例如调节细胞壁合成、分裂以及参与免疫调控过程。目前只有几十个底物蛋白被确认是由STPK进行调控,然而这些底物远远不足以解释STPK可能的重要功能。因此需要系统性发现与STPK相互作用的蛋白。蛋白质组芯片具有简单、快速、直接、高通量等优势,能够对激酶相互作用蛋白进行全局性发现。围绕Mtb体内STPK相互作用蛋白这一出发点,本研究利用蛋白质芯片主要进行了三方面工作:其一,全局性发现STPK与Mtb体内蛋白的相互作用网络以及功能研究;其二,STPK激酶PknB与其相互作用底物蛋白RmlA的功能学研究;其三,全局性发现STPK激酶PknG与人类蛋白的相互作用网络以及功能研究。首先,我们利用Mtb蛋白质组芯片与11种STPK进行蛋白-蛋白相互作用,发现了492个与STPK相互作用蛋白以及1,027个相互作用。构建了STPK-蛋白相互作用网络图,并且对其功能进行了定义。生物信息分析发现这些相互作用蛋白参与多种代谢过程中,包括双组份系统调控、转录调控,蛋白质降解以及维持细胞壁的稳定性。进一步的功能研究发现,PknG可以调控细胞壁组分肽聚糖合成途径的一个关键酶MurC,通过促进MurC的活性来增加细胞壁相关成分的合成以及维持细胞壁的稳定性。总之,全局性STPK-蛋白相互作用网络的构建可以用于进一步了解Mtb体内信号转导途径的重要资源,并为最终的抗结核药物开发提供指引。其次,基于第一部分工作,我们找到一个新的与激酶PknB相互作用蛋白葡萄糖磷酸胸腺嘧啶转移酶(RmlA),它是鼠李糖合成途径中的第一个酶,也是一个限速酶。实验中发现PknB可以磷酸化RmlA,采用质谱分析确定RmlA上的磷酸化位点,为T12、T54和T197三个磷酸化位点。通过结构分析发现T12位点存在于RmlA的活性中心附近。因此我们猜测磷酸化可能影响Mtb的毒性以及其细胞壁结构。为了验证这一假设,通过在耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Msm)中构建RmlA(T12A/T12D)的两个突变来进行生化以及表型分析,结果表明该突变使RmlA酶活性降低并导致细胞壁结构的改变,且突变菌株其侵染巨噬细胞的能力降低。总之,这些结果表明RmlA受PknB磷酸化的调控,且可能影响Mtb与宿主细胞的相互作用。再次,利用人类蛋白质组芯片来全局性地发现与STPK激酶中的PknG相互作用的人类蛋白质。总共发现了124个与PknG相互作用的蛋白质,这些相互作用蛋白质具有多种功能。从这些新发现的相互作用蛋白质中,其中人类蛋白质肽脯顺反异构酶A(CypA)与PknG有较强的相互作用。并且进一步通过体外和体内实验验证它们之间的相互作用关系。接下来的功能研究发明,PknG可以通过磷酸化CypA来降低CypA的蛋白水平。最终降低由NF-κB和ERK1/2信号途径引起的免疫反应。表型实验进一步表明PknG的过表达可以通过降低细胞因子的表达水平来促使Msm更好的存活于巨噬细胞中。此次研究中发现的其它与PknG相互作用的蛋白为后续系统性探究PknG在Mtb-宿主相互作用中的功能奠定了坚实的基础。综上所述,本课题通过利用Mtb蛋白质组芯片和人类蛋白质组芯片系统性地发现与Mtb中STPK激酶相互作用的蛋白,并进行了初步的功能研究。同时本研究的发现扩展了我们对于Mtb中STPK激酶在Mtb自身体内以及参与病原菌-宿主相互作用中的重要作用的理解,为后续Mtb相关机制研究以及药物研发提供了指引。