【摘 要】
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人类基因的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNP)与癌症的发生、发展和治疗密切相关,是多种癌症的生物标志物。恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌等常见癌症与基因SNP突变息息相关,均可采用体外分子诊断(In vitro molecular diagnosis,IVD)的方式来进行诊断,从而为后续癌症治疗提供合理的临床诊疗方案。目前现有的SNP检测技术种类繁多,
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人类基因的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNP)与癌症的发生、发展和治疗密切相关,是多种癌症的生物标志物。恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌等常见癌症与基因SNP突变息息相关,均可采用体外分子诊断(In vitro molecular diagnosis,IVD)的方式来进行诊断,从而为后续癌症治疗提供合理的临床诊疗方案。目前现有的SNP检测技术种类繁多,包括测序法、引物延伸法、探针杂交法、酶切法和酶连接法等。然而上述方法存在以下缺点:1)医院常规采用的下一代测序技术成本高、耗时长、对操作人员技术要求高,这导致测序法的覆盖面不够广;2)将核酸扩增技术(聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)、环介导等温扩增反应(Loop-mediated isothermal amplification reaction,LAMP)等)与序列特异性探针(TaqMan探针等)结合的检测方法能够降低成本,颇受研究人员青睐,但热循环仪器、荧光检测仪等贵重仪器的使用不利于便携式检测;3)同时,某些特殊的SNP突变难以用现有的探针准确检测。为了改进现有技术在实际应用中的不足,本论文开发了两种基于特异性核酸探针的SNP检测新方法:1、我们利用个人血糖仪(Personal glucose meter,PGM)、磁纳米链(Magnetic nanochains,MNCs)和自制便携式反应装置实现了对恶性黑色素瘤标志物B-Raf原癌基因(B-Raf proto-oncogene,serine/threonine kinase,BRAF)V600E 突变的SNP检测。在传统借助磁珠(Magnetic beads,MBs)的生物传感设计中,为了保证均匀的反应体系,必须用垂直混匀仪来实现磁珠的均匀分散,然而它不够便携以及不便于进行高温反应。因此我们采用能产生旋转磁场的自制便携式反应装置,使预先加入反应体系中的MNCs旋转从而起到持续搅拌反应液的作用,并可加快MBs和核酸等温扩增产物的传质速度,提高反应速率,同时自制装置中预先设计的加热板可有效地控制反应体系的温度。通过在MBs上修饰特异性的核酸链置换探针,能够实现突变型和野生型BRAF基因的单碱基错配的区分。更重要的是,MNCs的搅拌作用有效提高了微反应体系中的扩散效率,使突变型与野生型基因的反应速率差别更明显,从而进一步提升了单碱基错配检测的区分度。该方法避免了贵重仪器的使用,为突变基因的便携式检测开辟道路,有望用于各种致病基因SNP的早期筛查。2、我们引入利用两种新型四通结(Four-way junction,4WJ)和分子信标(Molecularbeacon,MB)核酸探针实现了对非小细胞肺癌标志物表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGFR)两个 SNP 突变位点 T790M 及 C797S 的同时检测,并能够有效区分两个突变位点的位置关系。这两个突变位点分别代表第一代及第三代表皮生长因子-酪氨酸激酶抑制剂(Epidermal growth factor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)的耐药突变,并且两者的顺式构型与反式构型会显著地影响患者对EGFR-TKIs的耐药性。因此对这两个位点顺反式突变的区分可以为个性化的治疗方案提供有效的临床诊断依据。为此,我们首先通过非对称PCR法对目标基因进行扩增,采用两步法识别扩增产物,即:1)首先通过特异性4WJ探针来判断EGFR T790M和C797S是否存在以及是否同时存在;2)当两个突变基因同时存在时,通过第二步特异性MB探针来确定两者的顺反式构型。该方法解决了当前特异性探针难以识别两个SNP位点位置关系的难题,为非小细胞肺癌患者的个性化治疗提供了有效的研判手段和理论依据。
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