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脾气虚动物模型的构建及优化是脾气虚证研究的重要内容,而模型的评价标准是脾气虚动物模型构建成功与否的关键环节。目前对脾气虚动物模型的外观体征评价大多以定性描述为主,缺少准确、客观定量的判断标准,易致评价模型动物外观体征时出现偏差,因而需要构建符合科学研究要求的脾气虚动物模型评价方法。唾液淀粉酶(salivary alpha-amylase,sAA)酸负荷前后活性比值、尿D-木糖排泄率是被行业认可的脾虚证疗效评价客观参考指标。研究表明,sAA属于N-糖基化蛋白,其活性与N-糖基化修饰密切相关;糖基转移酶(GnT-Ⅰ和GnT-Ⅱ)和α-甘露糖苷酶Ⅱ(MG-Ⅱ)是N-糖基化修饰的关键酶,直接影响N-糖基化程度。尿D-木糖排泄率、sAA活性比值及其影响因素(如N-糖基化修饰)等指标可作为评价脾气虚大鼠模型的重要客观指标。“以方测证”是评价证候模型的常用方法,益气健脾代表方四君子汤常用于干预脾气虚模型,以此来评价脾气虚动物模型的可靠性。研究目的基于脾气虚证外观体征指标优化脾气虚大鼠模型评价标准;筛选利血平粉末致脾气虚大鼠的最佳剂量,建立优化后的脾气虚证动物模型;在此基础上,从脾气虚证客观诊断指标尿D-木糖排泄率、sAA活性改变及其影响因素来评价利血平致脾气虚大鼠模型;观察四君子汤对利血平致脾气虚大鼠模型sAA活性及其影响机制的影响;为探讨“脾气虚证微观指标”及“脾主涎”的内涵提供参考。研究方法1、优化脾气虚大鼠外观体征评价标准:选取活动度、眼裂宽度、毛色、大便构成脾气虚大鼠外观体征评分R,作为外观体征半定量评价标准;大鼠颈部皮下注射利血平不同剂量(0.8、0.4、0.2mg·kg-1)造模,初步确立外观体征评价标准的可行性;以0.8mg kg-1利血平复制模型,并增加0.6 mg kg-1利血平剂量组造模实验,以此重复验证外观体征评价标准的客观性和可靠性,以建立利血平致大鼠脾气虚模型实验方案,并为后续选取利血平合适剂量用于脾气虚大鼠造模。2、对溴苯胺法测定尿D-木糖排泄率。3、Bemfeld法测定sAA活性。4、凝集素亲和沉淀法检测sAAN-糖链构成比。5、Western blot 法检测 sAA、GnT-Ⅰ、GnT-Ⅱ 和 MG-Ⅱ 蛋白表达。6、腮腺的病理组织学观察:HE染色光镜下观察腮腺组织形态改变;透射电镜下观察腮腺组织超微结构(细胞器改变及酸刺激前后酶原分泌颗粒变化等)。7、四君子汤水提物的提取和分析:称取四君子汤药材(人参、茯苓、白术、甘草各等份),浸泡,水煎煮,浓缩冷冻干燥得四君子汤冻干粉,高效液相法检测四君子汤水提物图谱。8、四君子汤给药方法及观察:大鼠先随机分为正常对照动物和造模动物;造模动物以利血平0.6 mg·kg-1剂量颈部皮下注射造模11天,利血平注射结束后将造模大鼠随机分为四君子汤高、低剂量组(10g·kg-1、5g·kg-1),盐酸氟西汀(简称百优解,3.5 mg·kg-1)组,人参皂苷Rb1(40mg·kg-1)组,模型恢复组;四君子汤两组(10g·kg-1、5g·kg-1)、盐酸氟西汀(百优解)组大鼠灌胃给药,人参皂苷Rb1组大鼠腹腔注射给药,模型恢复组灌胃等量生理盐水,共(造模11d+给药22d)33天;实验结束后,收集大鼠唾液、尿液,选取大鼠腮腺组织用于后续实验。研究结果一、利血平致脾气虚大鼠模型的优化1、外观体征评分标准的优化:按大鼠外观体征评分标准,实验期间每天监测造模大鼠的大体状态变化过程,以体征评分R>8或R<1为标准,判断大鼠脾气虚模型复制成功或恢复至正常的节点;以外观体征评分结合体重、摄食量、饮水量、肛温和腮腺组织形态检查对模型进行评价并优化了模型评价标准;该结果以利血平0.8mg·kg-1造模9天中得到重复,也在利血平0.6 mg·kg-1造模11天中得到验证。2、脾气虚大鼠尿D-木糖排泄率:造模大鼠尿D-木糖排泄率较正常组大鼠下降(P<0.05),说明脾气虚大鼠小肠吸收功能下降。3、脾气虚大鼠sAA活性:造模后大鼠酸刺激前后sAA活性较正常组大鼠下降(P<0.01),表明脾气虚大鼠唾液分泌出现障碍。4、脾气虚大鼠sAA N-糖基化影响因素的观察(1)sAA与刀豆凝集素(ConA)和麦胚凝集素(WGA)结合率:造模大鼠与ConA结合率高于正常组大鼠(P<0.01);表明脾气虚大鼠sAA N-糖链结构发生改变。(2)脾气虚大鼠sAA N-糖基化蛋白、糖基转移酶(GnT-Ⅰ、GnT-Ⅱ)、α-甘露糖苷酶Ⅱ(MG-Ⅱ)表达:初步实验证明造模大鼠sAA N-糖基化蛋白表达缺失,GnT-Ⅰ、GnT-Ⅱ表达有下降趋势,MG-Ⅱ无明显变化;提示sAA N-糖基化表达缺失及糖链结构改变可能与GnT-Ⅰ、GnT-Ⅱ表达改变有关。5、脾气虚大鼠腮腺病理组织学观察:腮腺组织HE染色光镜下观察,透射电镜超微结构观察发现,造模大鼠较正常组大鼠均出现明显病理改变,酸刺激后酶原颗粒较正常对照组多,但无明显统计学意义(P>0.05);表明脾气虚大鼠腮腺组织形态出现异常。二、四君子汤对脾气虚大鼠模型的干预作用1、四君子汤水提物的提取及检测:四君子汤水提物得率34.1%,高效液相色谱法检测到该样品有人参皂苷Rc、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Re、甘草酸、甘草苷、茯苓酸成分,并作为本研究的受试药。2、四君子汤对利血平致脾气虚大鼠外观体征评分的影响:四君子汤(10g·kg-1、5g kg-1)灌胃22天后,受试药组及模型恢复组外观体征评分均降低,四君子汤10g·kg-1组外观体征评分下降略快,但与模型恢复组比较无明显差异(P>0.05)。3、四君子汤对脾气虚大鼠尿D-木糖排泄率的影响:四君子汤(10g ·kg-1、5g·kg-1)组、人参皂苷Rb1组与模型恢复组比较均无明显差异(P>0.05);盐酸氟西汀(百优解)较模型恢复组尿D-木糖排泄率升高(P<0.01)。提示本实验中四君子汤及人参皂苷Rb1对脾气虚大鼠小肠吸收功能无明显影响,盐酸氟西汀(百优解)对脾气虚大鼠小肠吸收功能有改善作用。4、四君子汤对脾气虚大鼠sAA活性的影响:经给药干预后,四君子汤(10、5g·kg-1)组、盐酸氟西汀组、人参皂苷Rb1组脾气虚大鼠sAA活性有上升趋势,但与模型恢复组比较无统计学意义。5、四君子汤对脾气虚大鼠sAA N-糖链的影响:给药干预后,四君子汤10 g·kg-1、5g·kg-1组,盐酸氟西汀组(百优解)、人参皂苷Rb1组大鼠sAA与ConA结合率低于模型恢复组(P<0.05);四君子汤5g·kg-1组大鼠sAA与WGA结合率高于模型恢复组(P<0.01)。提示四君子汤组sAAN-糖链中活性较高糖链的构成多于模型恢复组,提示四君子汤对脾气虚大鼠sAA N-糖链结构异常有改善作用。6、四君子汤对脾气虚大鼠腮腺病理组织学的影响:经给药干预后,经腮腺病理组织以光镜及透射电镜观察,发现四君子汤(10g· kg-1、5g·kg-1)和盐酸氟西汀(百优解)与正常组大鼠腮腺组织比较在病理及超微结构上无明显差异;酸刺激后四君子汤5g·kg-1和盐酸氟西汀两组较模型恢复组酶原颗粒减少,提示给药组应激功能较好;表明四君子汤及盐酸氟西汀对脾气虚大鼠造成的腮腺病理组织改变有改善作用。研究结论基于外观体征评分指标优化了利血平致脾气虚大鼠模型,在该模型上可观察到大体指标、客观指标(尿D-木糖排泄率、唾液淀粉酶活性)、sAA相关指标(sAA活性、sAAN-糖基化蛋白表达、sAAN-糖链结构、糖基转移酶GnT-Ⅰ和GnT-Ⅱ、α-甘露糖苷酶MG-Ⅱ等的变化;四君子汤对脾气虚大鼠sAA活性及其影响因素的改变有一定干预作用。研究结果为利血平致脾气虚大鼠模型提供了优化后的评价方法,为探讨“脾主涎”分子机制提供了研究基础。