论文部分内容阅读
腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)是一种小的单链无包膜病毒。由于AAV具有无明显致病性、低炎症反应、宿主范围广和转染效率高等特点,是最有希望的基因治疗的病毒载体。已逐步将重组腺相关病毒(rAAV)作为基因药物研发及临床研究的载体,并取得鼓舞人心的进展。但是rAAV要用于临床,需要大量的制备rAAV来满足临床需要,同时其相应的质量控制体系必须建立。rAAV大量制备就需要大量的高质量原材料质粒DNA。因此需要建立适合大规模生产质粒DNA的简单经济的纯化工艺。本文采用碱裂解、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法及无机盐沉淀等分离技术纯化质粒DNA,并应用凝胶电泳、BCA蛋白检测试剂盒、内毒素检测试剂盒和qPCR对所纯化的质粒DNA的纯度进行检测,同时,通过细胞及动物转染实验对纯化的质粒DNA的生物活性进行检测。纯化后的质粒DNA超螺旋形式达到90%以上,产率达到80%以上,生物活性高,各项指标指标均符合药用质粒DNA质量标准。基因治疗病毒载体的质量控制体系最重要是病毒基因组滴度。基因组滴度与基因治疗的效果密切相关,同时还决定着病毒载体使用的剂量。本文使用紫外分光光度、非变性胶电泳、PCR和qPCR来检测rAAV的基因组滴度。UVspectrophotometry可以测定rAAV的衣壳率,而非变性胶电泳可以考察rAAV基因组的完整性。UV spectrophotometry和非变性胶电泳比PCR和qPCR测得rAAV的基因组滴度高。扩增片段的大小对PCR和qPCR测rAAV的滴度没有影响。而引物设计的位置会影响PCR和qPCR测rAAV病毒基因组滴度的测定。导致rAAV在滴度测定时,由于每个实验室选择的引物不同而无法统一比较rAAV的滴度。由于反向末端重复序列(Inverted terminal repeats,ITR)是重组腺相关病毒载体中不可缺少的顺式作用元件。本文实验证明可以使用ITR序列设计的引物来测定rAAV的滴度。由于对ITR设计引物的qPCR法可以广泛适用于所有的rAAV滴度的测定。因此对推动AAV滴度检测的标准化有重要意义。