异基因造血干细胞移植（Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation, allo-HSCT）是血液系统恶性疾病、部分免疫缺陷性疾病、遗传性疾病、代谢性疾病、及部分实体瘤的重要治疗手段,但是移植后疾病复发是导致移植病患死亡的首要原因。尽管过去30年allo-HSCT治疗技术已取得令人瞩目的进步,但对如何减少allo-HSCT后疾病复发及提高复发患者生存率仍进展甚微,原因在于allo-HSCT后白血病复发的确切分子机制迄今不明。本研究从白血病自身生物学特性与机体抗白血病免疫的内外调控机制,围绕急性白血病allo-HSCT后复发机制开展研究。第1章异基因造血干细胞移植后供者细胞来源的白血病复发机制研究Allo-HSCT后白血病复发分为两大类,一类复发的白血病细胞来源于正常的供者细胞,称为供者细胞白血病（Donor Cell Leukemia, DCL）, DCL是移植后较为少见的复发形式,发生率为0.13%-5%,DCL确切机制仍不明确,正常供者造血干/祖细胞的癌基因转化被认为是DCL发生的关键环节,通过DCL研究正常的供者干细胞如何在患者体内转变为恶性白血病细胞,亦是研究白血病发病机制的独特生物学模型。本研究设想在DCL病理过程中存在肿瘤“二次打击”模型,通过对临床发生移植后DCL患者的一系列动态标本,包括患者白血病初诊骨髓标本、化疗后完全缓解骨髓标本、移植前持续缓解期骨髓标本、移植后第1个月、第9个月、第12个月骨髓标本、移植后发生DCL时骨髓标本和患者口腔粘膜标本,以及其健康供者骨髓、外周血和口腔粘膜标本,检测是否动态发生目前己明确的、在白血病发生机制中起关键作用的两种类型基因突变：Ⅰ类突变包括FMS样酪氨酸激酶3基因（Fms-related Tyrosine Kinase3Gene, FLT3）,成神经细胞瘤RAS病毒致癌基因（Neuroblastoma RAS Viral Oncogene Homolog Gene, NRAS）,Ⅱ类突变包括转录因子CCAAT:增强子结合蛋白α基因（CCAAT Enhancer-binding Protein Gene, CEBPA）,髓系-淋系或混合系白血病基因（Myeloid-lymphoid or Mixed-lineage Leukemia Gene, MLL）,核磷蛋白基因（Nucleophosmin Gene, NPM1）。结果发现,健康供者的造血干细胞带有CEBPA基因家族性突变（584₅89dup）（“一次打击”）,但未引起白血病；敏感的供者干细胞在特殊的患者体内环境中获得了CEBPA基因的另外2个位点突变（247dupC和914₉16dup）（“二次打击”）最终恶性克隆转化成白血病细胞。本研究首次证实在移植后供者细胞来源的白血病复发中存在供者正常干/祖细胞动态获得关键功能基因-CEBPA基因多点突变,从而发生恶性克隆转化为白血病细胞,首次揭示allo-HSCT后供者细胞来源的白血病复发中存在多重基因突变打击机制,前期研究结果已以第一作者发表在血液学专业顶级期刊Blood杂志（IF9.898）。第2章CEBPA基因多点突变致急性白血病发生的分子机制研究为进一步明确CEBPA基因多点突变致急性白血病发生的分子机制,在本部分研究中,我们对第一部分研究中发现的CEBPA基因3个位点的突变：N’端家族性突变（584₅89dup,影响蛋白TAD2功能区）、N’端移码突变（247dupC,导致正常42KDa全长蛋白翻译提前终止,过度合成缺乏TAD1功能区的截短30KDa蛋白异构体）、和C’端突变（914₉16dup,影响蛋白bZIP功能区）,利用慢病毒质粒载体（pLenti6.3/V5-DEST）构建3种突变及CEBPA基因野生型的慢病毒质粒。将CEBPA基因野生型和各个突变体转染4种急性髓系白血病细胞株（K562, NB4, Kasum-1, HL60）,小鼠正常髓母细胞株（32Dcl3）,观察CEBPA基因不同类型突变对C/EBPa蛋白的抗白血病作用、细胞周期阻滞和促进粒系分化等三大重要功能的影响。结果发现：CEBPA基因N’端移码突变（247dupC）产生的截短的C/EBPa-30KDa蛋白具有Ⅰ类突变的作用,使细胞凋亡障碍,赋予细胞无限增殖的能力。影响TAD2功能区的CEBPA基因N’端家族性突变（584₅89dup）影响C/EBPa蛋白的周期阻滞功能。CEBPA基因C’端突变对C/EBPa蛋白抑制增殖、诱导凋亡和促进分化的功能均有损害,可能同时具有Ⅰ类和Ⅱ类突变的作用。我们的结果提示CEBPA基因不同位点突变在白血病发生的病理过程中,分别发挥Ⅰ类突变和Ⅱ类突变的作用。第3章异基因造血干细胞移植后患者自身细胞来源的白血病复发的基因分子机制研究基于90%以上allo-HSCT后复发的白血病细胞仍来源于患者自身细胞,虽然对这类复发普遍认为是患者残留放／化疗耐药白血病细胞克隆所致,但是越来越多研究证实白血病化疗后复发时,虽然复发的恶性细胞克隆与初发克隆具有某些相同的、来自更早期的前体细胞克隆起源,但是从初发到复发过程中产生了不同的基因突变,绝大部分复发克隆是由正常前体细胞或初发白血病细胞进一步获得新的基因突变后演变而来,少部分复发克隆则与初发克隆具有完全不同的基因背景,从初发到复发过程中白血病细胞克隆发生了克隆演变。因此我们设想在allo-HSCT后患者自身细胞来源的白血病复发中除了体内残留耐药白血病细胞克隆外,复发克隆亦可能是由初发白血病细胞或患者正常细胞获得新的基因突变成为优势克隆演变而来。在本部分研究中,我们为发现与成人急性淋巴细胞白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia, ALL）移植后复发相关的基因突变和明确在成人ALL从初诊到移植后复发过程中是否存在白血病细胞克隆演变,选择临床最常见ALL类型——Ph-、正常核型的前体B细胞型ALL,首次利用全基因组外显子测序技术,在全基因组范围内对患者初诊白血病细胞、移植前处于化疗后完全缓解期的血液细胞和allo-HSCT后发生复发时的白血病细胞进行基因背景比对分析,发现ALL从初诊到allo-HSCT后复发过程中存在3种白血病细胞克隆演变模式,第一种模式中,患者移植后复发的白血病细胞与初发白血病细胞具有完全相同的基因背景,复发克隆来自原发克隆,是原发克隆的再活化。第二种模式中,患者移植后复发的白血病细胞与初发白血病细胞具有某些相同的基因背景,可能起源于初发克隆中少数克隆或亚克隆,进一步获得新的基因突变而成为优势克隆。第三种模式中,患者移植后复发的白血病细胞与初发白血病细胞具有完全不同的基因背景,可能是由正常干/祖细胞获得特异性基因突变后产生的新的、恶性克隆。我们进一步将通过全基因组外显子测序获得的、可能与ALL移植后复发相关的25个基因突变位点所涉及的23个基因,在验证组患者标本中进行验证,并结合生物信息学、基因功能分析,筛选出与Ph-、正常核型前体B细胞型ALL发生allo-HSCT后复发相关的PTPN21基因突变。第4章异基因造血干细胞移植后白血病复发的免疫逃逸机制研究异基因造血干细胞移植不同于化疗的独特机制在于移植后的GVL效应,通过异体细胞免疫反应清除残留白血病细胞,是最终治愈白血病的关键,但是,最终导致复发的白血病细胞是如何逃逸GVL效应,其免疫逃逸机制目前仍不明确。在本部分研究中,我们为发现影响移植后GVL效应的关键分子,首次基于中国人群遗传背景,围绕一系列参与GVL免疫反应各个重要环节的分子,在中心接受allo-HSCT的白血病患者及其干细胞供者中开展这些参与GVL反应的重要分子包括：细胞因子—肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor-alpha, TNFa）及其受体、干扰素Y（Interferon-γ, IFNγ）、转化生长因子p（TransformingGrowth Factor-β, TGFβ）及其受体、白介素-10（Interleukin, IL-10）;免疫细胞受体—NK细胞表面重要激活型受体本NKG2D （Natural Killer Group2, Member D）和T细胞表面最重要的共刺激分子—CD28,可诱导共刺激分子（Inducible Co-stimulator, ICOS）和细胞毒性T淋巴细胞抗原4（Cytotoxic T-lymphocyte antigen4, CTLA-4）;免疫效应分子—粒酶B （Granzyme B）、死亡受体Fas及其配体；天然免疫相关基因—-Toll样受体（TLR1, TLR2, TLR3, TLR8, TLR9）等的基因型与移植后复发风险的关系研究,在这些众多的、参与移植后免疫反应各个重要环节的分子中发现干细胞供者CTLA-4和NKG2D的基因型、急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）患者的Fas基因型显著影响移植后白血病复发风险,首次报道接受干细胞供者为CTLA-4高表达基因型的患者或干细胞供者为NKG2D低表达基因型的患者,及Fas基因-670位点为TT基因型的AML患者,移植后复发风险明显增高,结果提示NKG2D、CTLA-4和Fas的表达高低影响allo-HSCT后异体反应性免疫活性细胞对白血病细胞的杀伤敏感性,为阐明白血病移植后复发的免疫逃逸机制找到关键靶点。研究结果已以第一作者发表在国际造血干细胞移植权威期刊《Haematologica》（IF6.424）、《Bone Marrow Transplantation》（IF3.746）和《Biology of Blood and Marrow Transplantation》（IF3.873）。结语：本研究的创新点在于：（1）在理论上,首次揭示allo-HSCT后供者细胞来源的白血病复发中存在多重基因突变打击机制,首次证实供者正常干/祖细胞动态获得关键功能基因—CEBPA基因多点突变,发生恶性克隆转化为白血病细胞。（2）首次关注CEBPA基因不同类型突变对C/EBPa蛋白的诱导细胞凋亡、细胞周期阻滞和促进粒系分化功能的影响。（3）对占allo-HSCT后白血病复发90%以上的患者自身细胞来源的复发,首次提出并证实存在关键性基因突变和白血病细胞克隆演变的创新性理论,并筛选出与成人急性淋巴细胞白血病发生移植后复发相关的PTPN21基因突变。（4）首次基于中国人群遗传背景,围绕一系列参与移植物抗白血病免疫反应各个重要环节分子的基因型与allo-HSCT后白血病复发风险的关系研究,首次报道干细胞供者CTLA-4和NKG2D的基因型、AML患者Fas基因型显著影响移植后复发风险,为阐明白血病移植后复发的免疫逃逸机制找到关键靶点。