研究背景非小细胞肺癌是恶性肿瘤性疾病引起死亡的主要原因,肺恶性肿瘤发病率高,总生存率低,其5年生存率小于15%。腺癌是非小细胞肺癌主要的病理类型,约50%以上非小细胞肺癌肿瘤病理类型为腺癌。尽管在化疗、分子靶向治疗等方面取得了进展,但是肿瘤复发与远处转移仍是引起肺腺癌患者死亡的主要原因。越来越多的证据表明,上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal-Transition,EMT)在多种恶性肿瘤的发生、耐药及复发、转移过程中发挥着重要的作用。有研究认为,EMT可以作为非小细胞肺癌患者的预后不良因素。因此,阐明上皮-间质转化的发生机制,寻找其分子靶点和有效的阻断药物,有可能有利于减少肿瘤转移、逆转肿瘤耐药,成为提高肺腺癌患者总生存期的关键。上皮-间质转化是指上皮细胞间失去正常状态下应有的细胞连接,细胞极性丢失,从而导致上皮细胞向间质-细胞转化,转化到间质细胞后细胞获得侵袭能力。转化后的间质性细胞表达vimentin和N-cadherin等间叶标记物,失去E-cadherin和γ-catenin等上皮性标记,这种变化通常被认为是上皮-间质转化过程的主要标志。在这个过程中,多种转录因子参与其中,例如:SNAIL、ZEB1、ZEB2、Twist等,直接或间接的发挥抑制E-cadherin表达的作用。另一方面,小RNA也参与了细胞上皮-间质转化的过程。有研究发现,小RNAmiR-200家族参与了上皮-间质转化的调控。实际上,无论是转录因子,还是小RNA的调控过程都是肿瘤细胞的内在性调控,而内在性调控受到肿瘤微环境中的介质活化信号通路的调控。现多个研究已证实,肿瘤微环境中的肿瘤转化生长因子beta(TGF-β)是调控肿瘤细胞发生上皮-间质转化的重要因子,该因子可促进多种肿瘤细胞发生上皮-间质转化并促进其侵袭、转移。在肿瘤微环境中,IL-6是一个重要的细胞因子,参与肿瘤的发生及发展过程。IL-6与其受体IL-6R结合后,可激活JAK/STAT3信号通路。有研究表明,乳腺癌、肺癌等恶性肿瘤患者血液中,血清IL-6处于高水平的情况下,肿瘤细胞生长快,复发、转移快,易发生耐药,这部分肿瘤患者常常生存期短,预后差。近年来有文献报道,在乳腺癌、卵巢癌中,IL-6可以通过活化JAK/STAT3信号通路,促进肿瘤转移及肿瘤细胞上皮-间质转化的发生。目前,很多临床性研究及临床上的回顾性分析中都有报导,肺癌患者血清IL-6水平的异常升高在肺癌患者中占有相当高的比例,而且这部患者常常处于肺癌晚期,伴有肿瘤广泛转移。或是化疗治疗中,疗效差,易发生耐药。因此我们考虑,IL-6在肺癌患者的疾病发展中,可能发挥促进肿瘤转移,参与诱导肿瘤细胞发生治疗耐药的作用,这种作用可能是通过诱导肺癌细胞发生上皮-间质转化而实现。目前尚无IL-6在肺腺癌上皮-间质转化发生过程中作用的研究及报道。作为糖尿病治疗常用药物,二甲双胍可以减少多种肿瘤的发病风险。临床回顾性的研究中发现,患有Ⅱ型糖尿病的病人服用二甲双胍治疗后,可减少肿瘤的发病风险。同时患有恶性肿瘤及Ⅱ型糖尿病的病人,服用二甲双胍治疗的患者与未服用者相比较,服用者总生存期明显占优势。这种生存优势与长期服用二甲双胍相关,短期服用者未能表现出这种生存上的差异。有研究发现,二甲双胍除了具有抗肿瘤活性外,还可以抑制前炎症因子的表达,二甲双胍可以抑制平滑肌细胞、内皮细胞及巨噬细胞释放IL-1β、IL-6、IL-8等前炎症因子,二甲双胍的这种抑制作用具有剂量依赖性。前炎症因子在肿瘤发展过程中发挥重要作用,二甲双胍通过抑制NF-κB的活性来抑制前炎症因子(如IL-6、IL-17等)的表达。在三阴性乳腺癌中,二甲双胍通过抑制STAT3磷酸化从而抑制肿瘤细胞生长及诱导肿瘤细胞凋亡。近年来有研究报道,在乳腺癌干细胞中,二甲双胍通过显著下调多种上皮-间质转化标志分子,例如:转录因子ZEB1、TWIST1及Slug等,从而调节肿瘤干细胞上皮-间质转化过程。基于以上研究,我们设想,IL-6可能通过JAK/STAT3信号通路参与肺腺癌上皮-间质转化过程,二甲双胍可能通过抑制STAT3磷酸化从而抑制IL-6诱导肺腺癌上皮-间质转化。目的:上皮-间质转化在恶性肿瘤侵袭、转移过程中发挥着重要作用,然而肺腺癌上皮-间质转化的机制仍不明确,如何抑制肺腺癌上皮-间质转化值得研究。本研究探讨了IL-6在肺腺癌上皮-间质转化过程中的作用及机制,二甲双胍在IL-6诱导肺腺癌上皮-间质转化过程发挥抑制作用。方法:1.基质胶侵袭实验侵袭实验前,transwell小室上层预先小心、均匀的预铺30μl基质胶(1:8稀释)。冰浴上预冷基质胶、移液枪头及transwell小室。transwell小室上层铺好基质胶后,在无菌操作台中室温条件下风干,吸出风干过程中小室中渗出的水份,紫外线消毒半小时后放入细胞培养孵箱中备用。肺腺癌细胞株HCC-827及A549均在无血清培养基中饥饿培养过夜。取出已预铺好基质胶的transwell小室,每个上层小室中,加入无血清RPMI 1640培养基50μl,置于细胞培养箱中水化2小时。取出已饥饿培养过夜的肺腺癌细胞HCC-827及A549,胰酶消化后吹打并制备单细胞悬液、离心,再用RPMI 1640无血清培养基重新悬起,制成单细胞悬液,细胞计数板计数。吸取2×104个细胞,用移液枪小心加入到transwell上室中。Transwell侵袭体系中加入50、100、500ng/mL三个不同终浓度的IL-6,上室终体积定于200μl,下室加入含2%胎牛血清RPMI 1640培养基600μl,细胞孵箱中培养18小时。二甲双胍抑制实验中,加入终浓度为50ng/mlIL-6,加入终浓度为1、5及10mmol/L二甲双胍,细胞培养箱中继续培养18小时。到预定时间后,取出transwell小室,用棉签小心试去上室中的肺腺癌细胞,以4℃预冷的4%多聚甲醛固定15分钟,PBS冲洗固定液后,0.1%结晶紫染色20秒,PBS冲洗结晶紫染液,倒置显微镜下观察、照像并计数,实验重复进行三次,统计结果。2.免疫荧光和免疫组化免疫荧光检测:肺腺癌肿瘤组织及癌旁组织在免疫荧光检测前,制备8μm厚冰冻切片,以预冷的4%多聚甲醛固定。肿瘤细胞在进行免疫荧光检测前,制备细胞爬片。细胞爬片放入六孔板中培养,加入终浓度为50ng/mlIL-6,二甲双胍抑制组加入终浓度为5mmol/L二甲双胍。肿瘤细胞株样本经过预处理到指定时间点后,以预冷的4%多聚甲醛固定15分钟。固定好的样本以预冷的PBS冲洗,以清除固定液。冲洗后在室温下以5%牛血清白蛋白封闭1小时。加入指定的一抗,4℃下过夜孵育。一抗稀释浓度分别为:E-cadherin 1:200、vimentin 1:50、p-STAT3 1:100。以预冷的PBS液充分冲洗一抗后,加入Cy3标记的二抗(1:500),室温下孵育1小时,以预冷的PBS液充分冲洗二抗。DAPI染细胞核5分钟,PBS冲洗DAPI后以抗荧光淬灭剂封片,于保湿的暗盒中保存,并于激光共聚焦显微镜下成像。免疫组化检测:肿瘤组织样本以10%福尔马林固定过夜,石蜡包埋,制备6μm厚切片。切片进行脱蜡,复水,H202封闭,抗原修复后,室温下以羊血清封闭1小时,甩去封闭液后加入指定浓度的一抗工作液,在4℃条件下孵育过夜,一抗浓度分别为:E-cadherin 1:400、vimentin 1:100、pSTAT3(Tyr705)1:400。DAB试剂盒显色。3.酶联免疫吸附实验(ELISA)通过酶联免疫吸附实验测定肿瘤组织和癌旁组织中pSTAT3(TYr705)和IL-6蛋白表达水平。酶联免疫吸附实验测定按照说明书进行,重复实验三次,统计结果。4.Real-time PCR实验用Trizol提取细胞或组织中总RNA,提取过程参照说明书进行。肺腺癌组织及癌旁组织提取RNA时,选取重约80mg左右组织,每个组织样品在冰浴中研磨,RNA提取成功后,测RNA含量,调整RNA含量,使之利于上样。尽可能避免过高浓度RNA,以减少上样时带来较大的误差。RNA提取后合成cDNA。E-cadherin、vimentin、snail及IL-6基因表达水平通过real-time PCR检测,建立10μl real-time PCR反应体系,ABI prism 7500 sequence detection system机器上进行反应,反应条件为:95℃ 30秒,95℃ 5秒共40循环,60℃34秒,72℃45秒,以GAPDH作为内参基因。实验重复三次,以2-△△ct计算法计算E-cadherin、Vimentin、Snail及IL-6相对mRNA表达水平。5.免疫印迹实验(Westernblot)已按指定条件处理的细胞样本,用预冷的PBS冲洗,去除培养基中蛋白的影响,冲洗后甩去多余的PBS液。于冰浴上细胞裂解液裂解细胞15分钟,并加入PMFS蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂,然后超声破碎15秒,获取全细胞裂解液,蛋白变性前测定蛋白浓度,并以细胞裂解液调整蛋白浓度,以利于电泳前上样。按试剂盒说明配制8%SDS-PAGE胶,80-100 v条件下电泳,电泳结束后进行转膜。室温下5%脱脂奶粉封闭1小时,以TBST充分洗去封闭液。一抗在4℃条件下孵育过夜,一抗稀释浓度分别为:p-STAT3(Tyr705)(1:2,000)、Stat3(1:2,000)、E-cadherin(1:1,000)、vimentin(1:1,000)、snail(1:1,000)及β-actin(1:2,000)。TBST充分洗膜,去除残留一抗,以HRP标记的二抗在室温孵育1小时,TBST充分洗膜,去除残留二抗,ECL试剂显像。6.裸鼠移植瘤实验4周龄裸鼠(雌雄各半)购自于中国医学科学院,饲养于SPF级环境中。实验分成 HCC827、HCC827-pSB388、HCC827-pSB388+Met 三组,每组 6 只,雌雄各半。HCC827 和 HCC827-pSB388 两组给予饮用 PBS 作为治疗。HCC827-pSB388+Met 组在饮用的PBS中加入二甲双胍作为治疗。二甲双胍给药量按250毫克/公斤体重/天计算。各组裸鼠在注射肿瘤细胞前2天开始进行饮用指定的饮水,治疗至任一组裸鼠全部死亡时结束。HCC827组裸鼠皮下种植2×106个HCC827细胞,HCC827-pSB388组和HCC827-pSB388+Met组裸鼠皮下种植2×106个HCC827-pSB388细胞。隔天测量肿瘤大小1次,肿瘤体积(mm3)=长×宽2/2。未自然死亡裸鼠以CO2麻醉处死。结果:1.IL-6诱导肺腺癌细胞A549和HCC827上皮-间质转化并促进肿瘤细胞侵袭。A549和HCC827具有典型的上皮性形态:鹅卵石形态和集落生长。在50ng/ml IL-6诱导下,A549和HCC827细胞转变成典型的间质形态:纤维状、分散生长状态。肿瘤细胞侵袭实验证明,IL-6诱导可显著促进肿瘤细胞A549和HCC827侵袭,这种促侵袭作用具有剂量依赖性。同时,免疫印迹、real-time PCR、免疫荧光检测提示:A549和HCC827在用50ng/mL IL-6处理后,上皮性标记E-cadherin表达下降,间叶性标记vimentin和snail表达升高。2.肺癌组织中,IL-6表达水平与vimentin表达水平呈正相关。我们用定量PCR检测了 18例已确诊的肺腺癌肿瘤组织,6例癌旁组织中IL-6、E-cadherin和vimentin mRNA的表达情况。IL-6 mRNA在癌旁组织中表达水平明显低于肿瘤组织。肿瘤组织中,IL-6 mRNA和vimentin mRNA表达呈正相关；IL-6 mRNA与E-cadherin mRNA表达呈负相关。免疫荧光检测结果表明,在低表达IL-6肿瘤组织中,vimentin蛋白表达相对较弱,而E-cadherin蛋白表达较强;在高表达IL-6肿瘤组织中,vimentin蛋白表达较强,而E-cadherin蛋白表达较弱。3.在细胞水平和肿瘤组织内,IL-6可促进肿瘤细胞STAT3磷酸化。研究发现,在50ng/mL浓度下,IL-6可以活化肺腺癌A549和HCC827细胞STAT3,诱导STAT3酪氨酸残基在Tyr705上发生磷酸化,磷酸化的STAT3表达水平在30分钟时间点达到高峰,120分钟后下降到正常水平。而高表达IL-6细胞株HCC827-pSB388细胞中,磷酸化STAT3持续高表达,而不表达IL-6细胞株HCC827细胞和HCC827-pLVT7细胞中,其磷酸化STAT3表达水平明显低于HCC827-pSB388细胞。这些结果说明,在IL-6诱导肺腺癌EMT过程中,STAT3磷酸化有重要作用。同时,在肺腺癌组织中IL-6表达水平与STAT3磷酸化水平明显相关。高表达IL-6肺腺癌组织中,STAT3磷酸化水平亦明显高于低表达IL-6肺腺癌组织。4.二甲双胍抑制IL-6诱导肺腺癌细胞上皮-间质转化。实验结果表明,二甲双胍在5mmol/mL及10mmol/mL浓度下,可以显著的降低IL-6诱导下肺腺癌细胞A549和HCC827细胞的侵袭能力。二甲双胍在10mmol/mL浓度下的抑制强度与STAT3选择性抑制剂Cuc在2μmol/L浓度下的抑制强度相似。同时,实时定量PCR检测、免疫印迹检测、免疫荧光检测证明:二甲双胍可以显著抑制IL-6诱导的vimentin和snail表达升高,部分恢复IL-6诱导的E-cadherin表达下降。5.二甲双胍可以抑制IL-6诱导的裸鼠移植瘤生长及转移。我们用慢病毒在肺腺癌HCC827细胞株上建立了稳定、高表达人IL-6的细胞株HCC827-pSB388。免疫印迹检测证实:过表达IL-6,使HCC827-pSB388细胞株E-cadherin表达下降,vimentin表达升高。细胞侵袭实验亦证实该细胞株侵袭力增加。裸鼠移植瘤实验中,我们发现高表达IL-6移植瘤组HCC827-pSB388组肿瘤体积显著大于非表达IL-6移植瘤组HCC827组肿瘤体积,接受二甲双胍治疗后,肿瘤长生明显受到抑制。高表达IL-6组,无论HCC827-pSB388组还是HCC827-pSB388+Met组,裸鼠肺部都可检测到微小转移病灶。但是二甲双胍治疗组裸鼠肺部转移病灶的数量明显少于非治疗组。无IL-6表达组HCC827组未发现有转移病灶。同时三组裸鼠肿瘤组织中,我们用免疫组化检测了上皮-间质转化标记物的表达情况。高表达IL-6 HCC827-pSB388组肿瘤组织与非表达IL-6 HCC827组肿瘤组织比较,HCC827-pSB388组肿瘤组织E-cadherin表达下调,而vimentin表达明显上调。HCC827-pSB388组与HCC827-pSB388+Met组比较,这种变化可因二甲双胍治疗而减轻。6.二甲双胍通过抑制IL-6诱导的STAT3磷酸化途径抑制肺腺癌细胞上皮-间质转化。实验结果表明:在A549、HCC827和HCC827-pSB388细胞株中,二甲双胍可以显著的抑制IL-6诱导的STAT3磷酸化,二甲双胍的这种抑制作用具有剂量-时间依赖性。免疫荧光检测HCC827-pSB388、HCC827-pSB388+Met和HCC827-pSB388+Cuc三组细胞中p-STAT3表达情况说明,p-STAT3确实可以被二甲双胍抑制,其抑制效果接近于p-STAT3选择性抑制剂Cuc。裸鼠移植瘤免疫组化检测结果显示:高表达IL-6的HCC827-pSB388组裸鼠移植瘤组织中p-STAT3表达水平明显高于不表达IL-6的HCC827组裸鼠移植瘤组织。二甲双胍治疗组裸鼠移植瘤组织中p-STAT3表达水平亦明显低于非治疗组HCC827-pSB388组移植瘤组织。结论:1.IL-6可以诱导肺腺癌细胞株A549和HCC827细胞上皮-间质转化并促进其侵袭。2.IL-6通过活化STAT3诱导肺腺癌A549和HCC827细胞上皮-间质转化。3.二甲双胍通过抑制STAT3活化从而抑制IL-6诱导肺腺癌细胞上皮-间质转化。4.二甲双胍可抑制肺腺癌生长、转移,这种特性可能使二甲双胍具有潜在的临床应用价值。