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目的本研究旨在通过检测Rac1在喉癌中的表达来探讨Rac1在喉癌的发生及发展过程中的作用。并应用miRNA技术靶向封闭Rac1基因,观察在Rac1基因被封闭后喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡的情况,为喉癌的基因治疗寻找新的靶点,开辟一条新思路。方法1.应用免疫组织化学SP法检测喉癌组织、癌旁组织、对照组中Rac1蛋白的表达。2.应用分子生物学技术,模拟内源性miRNA,设计靶向Rac1基因的miRNA,选取3个位点构建重组质粒。然后应用脂质体Lipofectimine 2000转染人喉癌Hep-2细胞。3.应用半定量RT-PCR检测转染后Rac1 mRNA的水平,应用Western-blot检测转染pRac1miR/GFP-733重组质粒后Rac1基因的蛋白表达水平。4.观察转染后细胞生长情况,应用MTT试验观察转染的靶向Rac1的重组质粒对喉癌细胞体外增殖的影响。5.通过吖啶橙染色及流式细胞术检测喉癌细胞凋亡情况。通过细胞爬片组化染色观察Hep-2细胞的形态学变化。结果1.Rac1蛋白在对照组中无表达,在喉癌中染色阳性率为69%,显著高于癌旁组织的阳性率12%,喉癌组织与癌旁组织及对照组比较差异有显著性(均P<0.01)。2.构建的重组质粒经酶切鉴定、测序比对后证明与电脑设计的相符,表明所构建的重组质粒成功。应用脂质体转染后倒置荧光纤维镜观察转染效果,重组质粒在Hep-2细胞中成功表达。3.应用半定量RT-PCR检测转染后靶mRNA的水平,在转染后72h可检测到Rac1 mRNA的表达量下降显著,尤以转染pRac1miR/GFP-733明显,而未转染组及转染pLacZ-miR/GFP(对照)组未见此改变。应用Western-blot检测转染pRac1miR/GFP-733重组质粒Rac1基因的蛋白表达水平,发现Rac1基因的蛋白条带减弱,说明该质粒对蛋白表达有抑制作用。4.从细胞生长曲线上可以看出,转染pRac1miR/GFP-733的Hep-2细胞组的生长速度慢于Hep-2组和空质粒组,且差别具有显著性(P<0.01)。应用MTT比色法,我们测得空质粒组及Hep-2细胞组的细胞增殖强于转染pRac1miR/GFP-733的Hep-2细胞组的细胞,且差异有显著意义(P<0.01)。5.吖啶橙染色观察喉癌细胞凋亡情况,结果在正常Hep-2活细胞中可见均匀的黄绿色荧光,转染pRac1miR/GFP-733的Hep-2细胞组中可见较多的凋亡细胞呈致密浓染颗粒或块状黄绿色荧光,Hep-2和空质粒组中未见凋亡细胞。转染pRac1miR/GFP-733的Hep-2细胞组流式细胞仪检测显示,G1峰前面出现较高的亚2倍体峰(即凋亡峰)。而未转染的对照组和转染空载体组未见或仅见低平的亚2倍体峰。细胞爬片组化染色观察Hep-2细胞的形态学发现转染组中细胞大小较均匀,核浆比例明显减少,染色较淡,核形态多为圆形,可见凋亡小体。而对照组中可见细胞大小不等,外形多为梭形,多边形,核形态不规则,可含有多个核仁,胞浆黄色染色较深。结论1. Rac1在喉癌中的异常表达可能与喉癌的发生有关,Rac1可能在喉癌的发生及发展过程中发挥重要作用。2.应用miRNA靶向封闭Rac1基因的表达,发现抑制Rac1基因能诱导喉癌细胞凋亡,并抑制其生长,提示Rac1基因可以作为喉癌基因治疗的靶点,这可能为喉癌的基因治疗提供一条新的途径。