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牙菌斑是附着于牙齿表面由700多种微生物组成的复杂生物膜,其中口腔常驻菌与龋齿致病菌--变形链球菌(Streptococcus mutans)间存在复杂的种间竞争,其竞争结果决定牙齿的健康状态。寡发酵链球菌(Streptococcusoligofermentans)是本实验室分离自健康人牙菌斑的链球菌新种。前期研究表明,S.oligofermentans具有多种酶,产生大量过氧化氢(H2O2)抑制S.mutans生长。其中,乳酸氧化酶(Lactate oxidase,Lox)以S.mutans的毒性代谢产物乳酸为底物产生H2O2,反过来特异性地抑制S.mutans生长。同时它也能耐受高浓度的H2O2,说明它具有很强的抗氧胁迫能力。这些特点使S.oligofermentans成为一个潜在的预防龋齿的口腔益生菌。
本研究通过基因组生物信息学分析、生物化学及分子生物学方法,在S。oligofermentans中鉴定了丙酮酸氧化酶(Pyruvate oxidase,Pox)的同源基因。pox基因突变株丧失氧化丙酮酸盐的能力,而pox突变回补菌株恢复该活性。pox缺失使S.oligofermentans H2O2产量显著减少。进一步研究表明,Pox主要贡献于生长早期及对数期的H2O2产生,而乳酸氧化酶(Lox)主要贡献于稳定期的H2O2产生。基因表达时相研究表明pox及lox基因在S.oligofermentans整个生长期中均为组成型表达,而lox基因在稳定期表达量增加,是生长早期表达量的2.5倍;Pox与Lox的酶活水平在整个生长期中持续升高。由于S.oligofermentans的代谢中间产物丙酮酸在生长早期及对数期产量充足,而终产物乳酸的积累在静止期达到峰值,因此底物浓度与基因表达水平共同决定Pox和Lox途径的H2O2产生。更为重要的是我们发现,pox失活使S.oligofermentans以乳酸为底物时的H2O2产量明显下降,即pox失活显著降低了Lox活性,说明Pox与Lox具有协同作用。体外竞争实验表明,pox突变株失去抑制S.mutans生长的能力。因此Pox赋予S.oligofermentans在早期拮抗致龋菌的能力,并且Pox与Lox间的协同作用使S.oligofermentans能够利用乳酸产生最大量的H2O2,使其在与S.mutans的种间竞争中处于优势地位。生物信息学分析发现,pox、lox同源基因也存在于在其他口腔常驻链球菌,如S.mitis,S.cristatus,S.oralis及S.infantis。因此,推测上述两种酶的协同作用在口腔链球菌的种间竞争中具有一定普遍性,对于维持牙菌斑的生态平衡具有重要意义。