糖基化修饰是一种普遍存在的翻译后修饰,广泛参与了细胞的多种生命过程,包括信号转导、细胞凋亡、转录调控、免疫反应、炎症反应等生理过程,以及肿瘤、神经退行性等疾病发展过程中,对糖基化修饰的研究有重要意义。但是,糖研究工具的缺陷阻碍了整个领域的研究进程。在目前的研究中,凝集素和糖抗体为主要的糖生物学识别工具,然而这两者在特异性和亲和力上都有待提高,不能够很好地满足研究的需求。因此,寻找更优的糖基化修饰识别工具以及探究改进工具的方法学研究具有重要意义。我们课题组成功改造了AANL(一种真菌凝集素,能够特异性地结合Glc NAc(acetylglucosamine,乙酰葡萄糖胺))糖识别结构域(carbohydrate recognition domain,CRD),获得了亲和性和特异性更好的凝集素AANL6,为Glc NAc为末端的糖修饰研究提供了有力的工具。本文以TL2(Tachylectin-2,一种分离自日本马蹄蟹,能够特异性结合Glc NAc和Gal NAc(acetylgalactosamine,乙酰半乳糖胺)的凝集素)的晶体结构为基础,用改造AANL的相同策略对TL2进行改造,以期获得特异性更强的糖识别工具。同时,对人galectin(半乳糖凝集素)家族成员的糖谱数据进行深入挖掘,为利用人galectin作为糖识别工具和生物学意义的研究提供新思路。TL2在结构上与AANL非常相似,是由多个串联的相似氨基酸序列构成,AANL成功改造的方法(CRD均一化方法)在TL2上同样具有可行性。根据TL2自身的序列特点,设计两种改造方案,一种对β折叠片层内的氨基酸进行保留,另一种对β折叠片层内的氨基酸也进行均一化处理,即将CRD的关键氨基酸全部换为其中某一CRD的氨基酸序列,按照方案不同将突变体分别命名为TL21-TL25和TL2a-TL2b,最终成功表达并分离纯化出三个TL2的突变体:TL22、TL2b和TL2c,这些重组表达的凝集素都保留了对Glc NAc的亲和能力。通过糖芯片检测发现,TL2b与TL2c相比于TL2对Glc NAc的亲和能力都有大幅度的提高,其中TL2b还额外增加了对Man末端糖基化修饰的结合能力。在随后的等温滴定量热法(ITC)检测中,发现相比于TL2,TL22和TL2c均丧失了对Gal NAc的结合能力,这达到了我们所期望的结果:TL2的突变体提高了对Glc NAc的亲和能力,同时丧失了对Gal NAc的亲和能力。为探究糖识别工具的其他方案,我们对galectin家族成员进行了分析。Galectin是一类通过高度同源的保守CRD特异性的识别β-半乳糖苷的凝集素。Galectin家族在人的基因中有13个成员,在生物体内参与多种关键功能,包括细胞信号转导、细胞凋亡、细胞分化、免疫应答等。Galectin被报道都具有β-galactose的识别活性,但不同的galectin家族成员之间有冗余功能也有特异功能,功能的相似和差异性极有可能与各成员的不同糖基化修饰密切相关,但没有文献具体报道。我们下载了美国CFG(consortium of functional glycans)的7种人galectin糖谱数据,放弃传统的柱状图分析方法,用本实验室创新的“末端糖集合分析法”将数据重新整理、分类、统计后绘图,发现了不同galectin的独特糖识别规律。在被galectin识别的糖结构中,有些糖结构能够同时被多个galectin所识别,而有些糖结构则为某种galectin成员特异性识别的。发现galectin-1、-9对不同糖基化末端的识别并没有表现出显著的特异性,且整体的亲和力相对家族其他成员较弱,略倾向于结合Galβ1-4Glc NAc末端的糖基化修饰。而galectin-2、-4、-7、-8都具有良好的特异性,galectin-2主要结合Fucα1-2Galβ1-4Glc NAc的结构;galectin-4主要结合Gal NAcα1-3(Fucα1-2)Galβ1-4Glc的结构,galectin-7只结合Fucα1-2Galβ1-4Glc NAcβ1-3Galβ1-4Glc NAc的结构,galectin-8主要结合Galβ1-4Glc NAc为循环的串联重复的多分岔结构。Galectin-3的情况最为特殊,它所亲和的糖基化末端与所分析的其他6种galectin成员均产生交叉,能够结合galecitn-1、-8、9均主要结合Galβ1-4Glc NAc的结构,并与Galectin-2、-4之间存在共同结合的糖结构,且galectin-3和galectin-2之间还存在特有的共同结合糖结构,另外与Galectin-2、-7之间也存在三者共同结合的糖结构。此外,galectin-1和galectin-7,galectin-8和galectin-9也分别存在所识别糖结构的交叉现象。这种galectin成员之间对糖结构识别的交叉很可能与它们在生理功能上的冗余有关。在所有进行分析的galectin成员中,galectin-7的特异性最好,成功将其在体外进行表达纯化后,根据其偏好结合的糖基化修饰的特点对galectin-7与岩藻糖基转移酶之间的影响进行初步探究,结果表明,galectin-7对细胞的刺激更容易引起岩藻糖基转移酶(Fut1-Fut7)的高表达。我们的“末端糖集合分析法”对galectin糖谱重分析得到了重要的不同galectin家族成员识别糖链的结构信息,发现了它们结合糖的共性和特异性,为解释不同成员之间的冗余功能和特异性功能提供了重要线索,为进一步研究galectin的功能提供了有价值的数据。