论文部分内容阅读
背景：肿瘤细胞向周围或远隔的重要脏器侵袭和转移是导致肿瘤患者病情难以控制最终导致死亡的常见原因。侵袭和转移是一个极其复杂的、涉及肿瘤与宿主间相互作用的多步骤的过程，这个过程是促进转移的基因激活和抑制转移的基因失活的多基因协同作用的结果。神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)在一岁以上患者恶性程度很高，50％以上的病例就诊时就有远处转移，寻找与神经母细胞瘤侵袭转移相关的基因对于判断预后、改善疗效具有重要意义。近来研究发现S100A4基因可能通过影响细胞运动能力促进肿瘤的侵袭和转移，与肿瘤转移密切相关的基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)可能也受到S100A4表达的调节。目前，还没有S100A4参与神经母细胞瘤细胞侵袭和转移行为的直接证据，因此，明确S100A4与神经母细胞瘤侵袭转移的关系，可以为抗神经母细胞瘤转移的基因治疗筛选候选基因及提供实验依据。本研究观察利用反义寡聚核苷酸技术抑制S100A4基因的表达能否影响神经母细胞瘤细胞的侵袭能力，并探讨S100A4基因在调控神经母细胞瘤侵袭转移作用中可能的机制。 方法：本研究以两种高表达S100A4基因的神经母细胞瘤细胞系LA-N-6和SK-N-SH为体外模型，以人S100A4 mRNA序列5’翻译起始位点第70～89位碱基为反义作用靶点，人工合成20聚反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，asODN)，并以其正义链和错义链为对照，通过脂质体包裹的方法进行细胞转染。采用半定量逆转录-聚合酶链乎凡沪~军澎舀凳护毖学夕;甘戈呻反应(reverse transeription一polymerase ehain reaetion，RT一peR)方法在mRNA水平检测asODN对两种神经母细胞瘤细胞5 1 OOA4表达的抑制作用和对MMP一2表达的影响，以比色法检测asODN对两种神经母细胞瘤细胞的细胞活力的影响，以Transwell滤膜小室法检测神经母细胞瘤细胞体外侵袭和运动能力。 结果:1.分别用0.3协mol/L、0.6林mol/L、0.9协mol/L浓度的asODN转染神经母细胞瘤LA一N一6和SK一N一SH细胞系，两株细胞5100A4 mRNA的表达均有明显减少，与未经药物处理的对照细胞相比，差异有显著性 (P值均<0.05)，该抑制作用随给药浓度增大而加强，0.9林mol/L浓度的asODN抑制作用最为显著;转染后24h，5 1 00A4 mRNA的表达即被明显抑制，延长作用时间抑制作用减弱;转染正义链和错义链的对照组细胞5100A4 mRNA水平没有显著改变，说明反义抑制作用是特异的。2.转染5100A4 asODN后的LA一N一6细胞体外侵袭能力受到明显抑制，侵袭细胞数(2 .33士1 .15)明显少于未经药物处理的对照组(9.00士2.65，P=0.03)，而经正义链和错义链转染的细胞侵袭能力无明显变化。3.转染SIOOA4asODN的LA一N一6细胞体外运动趋化能力也受到抑制，趋化细胞数(9.33士4.73)明显少于未经药物处理的对照组(20.67士2.89，尸二0.03)，而经正义链和错义链对照转染的细胞运动趋化能力无明显变化。4.LA一N一6和SK一N一SH细胞转染S10OA4 asODN后，两株细胞中MMP一2mRNA的表达分别被下调25 .5%和21 .4%，而转染正义链和错义链的细胞中MMP一2 mRNA水平均没有显著改变。 结论:脂质体介导的S10OA4反义寡核普酸能够抑制神经母细胞瘤LA一N一6和SK一N一SH细胞中5100A4 mRNA表达，抑制LA一6细胞体外侵袭能力、运动能力，同时下调两种细胞中MMP一2 mRNA的表达，因此，SIOOA4基因在神经母细胞瘤侵袭过程中发挥重要作用;其作用机制公尹左夕拳几澎廷萝脱，须土一学莎不旨丈中灵撇萝可能与增加肿瘤细胞运动能力，调节MMP一2基因表达有关。